ASTM A790 2507/2205 1.4462/1.4410 أنبوب ملحوم مزدوج للمكونات الكيميائية للصناعات الكيماوية، يؤدي نقص SPECC1L إلى زيادة ثبات المفاصل المقسمة وتقليل تساقط خلايا القمة العصبية القحفية.

شكرا لكم لزيارة Nature.com.أنت تستخدم إصدار متصفح مع دعم محدود لـ CSS.للحصول على أفضل تجربة، نوصي باستخدام متصفح محدث (أو تعطيل وضع التوافق في Internet Explorer).بالإضافة إلى ذلك، ولضمان الدعم المستمر، نعرض الموقع بدون أنماط وجافا سكريبت.

ASTM A790 2507/2205 1.4462/1.4410 أنبوب ملحوم مزدوج للصناعات الكيميائية

ياوتشنغ سيهي SS المواد المحدودةهي شركة رائدة متخصصة في الأنابيب غير الملحومة من الفولاذ المقاوم للصدأ والأنابيب الملدنة الساطعة والأنابيب الملتفة غير الملحومة وما إلى ذلك.من أجل التسهيل على العملاء، قمنا بلحام الأنابيب والأنابيب أيضًا.ياوتشنغ سيهي SS المواد المحدودةلديها معدات الإنتاج والاختبار الأكثر تقدما.يمكننا تلبية الاحتياجات الخاصة بك تماما.وفقًا للمعايير الصارمة للغاية، فإن الأنابيب التي ننتجها تتمتع دائمًا بتسامح صحيح مع OD وWT.مراقبة التسامح تتوافق بشكل صارم مع معايير الإنتاج.منتجاتنا دائما راضية عن العملاء.العملاء الذين اشتروا منتجاتنا خلقوا المزيد من الأرباح.
أ) OD (القطر الخارجي): 3.18 مم إلى 101.6 مم
ب) WT (سمك الجدار): 0.5 مم إلى 20 مم
ج) الطول: حسب متطلبات العميل
د) المعايير: ASTM A312؛أستم A269؛أستم A789؛أستم A790 الخ
ه) طريقة العملية: المتفجرات من مخلفات الحرب، EFW الخ

أشرطة التمرير تعرض ثلاث مقالات لكل شريحة.استخدم زري الرجوع والتالي للتنقل عبر الشرائح، أو أزرار التحكم في الشرائح الموجودة في النهاية للتنقل خلال كل شريحة.
تتخلص خلايا العرف العصبي القحفي (CNCC) من الطيات العصبية الجنينية وتهاجر إلى الأقواس البلعومية، التي تشكل معظم هياكل الوجه الأوسط.يلعب خلل CNCC دورًا مهمًا في مسببات الشق الفموي الوجهي، وهو تشوه خلقي شائع.تم العثور على طفرات SPECC1L غير المتجانسة في المرضى الذين يعانون من الشقوق غير النمطية والمتلازمية.هنا، نقوم بالإبلاغ عن تلطيخ محسّن لمكونات الوصلة اللاصقة الأساسية (AJ)، وβ-catenin وE-cadherin في خلايا ضربة قاضية SPECC1L المزروعة، وتظهر الصور المجهرية الإلكترونية الانتشار القمي القاعدي لـ AJ.لفهم دور SPECC1L في التشكل القحفي الوجهي، قمنا بإنشاء نموذج فأر يعاني من نقص Specc1l.تعتبر المسوخات المتماثلة قاتلة جنينية وتظهر ضعفًا في إغلاق الأنبوب العصبي وتصفيح CNCC.يتم زيادة تلطيخ البروتين AJ في الطيات العصبية المتحولة.يتوافق عيب AJ هذا مع خلل في تصفيح CNCC، مما يتطلب حل AJ.بالإضافة إلى ذلك، أدت طفرات Specc11 إلى تقليل إشارات PI3K-AKT وزيادة موت الخلايا المبرمج.في المختبر، كان التثبيط الخفيف لإشارات PI3K-AKT في الخلايا البرية كافيًا للحث على تغييرات AJ.الأهم من ذلك، يمكن عكس تغييرات AJ الناجمة عن ضربة قاضية SPECC1L عن طريق تنشيط مسار PI3K-AKT.تشير هذه البيانات مجتمعة إلى أن SPECC1L، باعتباره منظمًا جديدًا لإشارات PI3K-AKT وبيولوجيا AJ، مطلوب لإغلاق الأنبوب العصبي والتقسيم الطبقي CNCC.
تتمركز خلايا القمة العصبية القحفية (CNCCs) في الجلد العصبي الظهري وتنفصل عن الظهارة العصبية للطيات العصبية النامية من خلال عملية تنطوي على الانتقال الظهاري الوسيطي (EMT) 1،2،3.تعمل CNCCs الظهارية السابقة على تعطيل الوصلات بين الخلايا وتصبح CNCCs الوسيطة المهاجرة التي تملأ القوسين البلعوميين الأول والثاني وتشكل معظم الغضروف القحفي الوجهي.وهكذا، غالبًا ما تتعطل الجينات التي تنظم وظيفة CNCC في مسببات التشوهات الخلقية القحفية الوجهية مثل الشقوق الفموية الوجهية، والتي تؤثر بشكل شائع على 1/800 ولادة في الولايات المتحدة وحدها.8-أحد التشوهات الخلقية.
يتزامن انفصال CNCC مع إغلاق الأنبوب العصبي الأمامي بين 8.5 و 9.5 يومًا من التطور الجنيني في الفئران.تُظهر طفرات عدد من الجينات المرتبطة بالشق الفموي الوجهي للفأر أيضًا شكلاً من أشكال عيوب الأنبوب العصبي، بما في ذلك Irf69,10، وGhrl310، وCfl111، وPdgfrα12.ومع ذلك، يمكن اعتبار عمليات إغلاق الأنبوب العصبي والتقسيم الطبقي CNCC مستقلة، حيث يُظهر الماوس المتحول Splotch (Pax3) عيوبًا في إغلاق الأنبوب العصبي دون أي تأثير على التقسيم الطبقي CNCC أو الهجرة 13،14.سوف تساعد نماذج الماوس الإضافية التي بها عيوب في تشريح CNCC وإغلاق الأنبوب العصبي في تحديد الأساس الجزيئي المشترك لهاتين العمليتين.
يتطلب عزل CNCC من الخلايا الظهارية العصبية حل الوصلات اللاصقة (AJs)، التي تتكون من مجمعات بروتينية تحتوي، من بين أشياء أخرى، على E-cadherin وβ-catenin وα-E-catenin وα-actinin المرتبط بخيوط الأكتين 2 أظهرت دراسات الإفراط في التعبير عن الكادهيرين الإلكتروني في الطيات العصبية انخفاضًا أو تأخيرًا في تصفيح CNCC.على العكس من ذلك، يؤدي قمع E-cadherin إلى التقسيم الطبقي المبكر.العديد من العوامل التي تتوسط EMT أثناء التقسيم الطبقي CNCC هي عوامل النسخ (AP2α، Id2، FOXD3، SNAIL، TWIST، SOX10) وبروتينات إعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلية (ECM) مثل البروتينات المعدنية المصفوفية (MMPs)، ومع ذلك فإن CNCCs هي منظمات AJ مباشرة للهيكل الخلوي. لم يعرف بعد.من المعروف أن مسار PI3K-AKT يعادي مستويات E-cadherin، خاصة من أبحاث السرطان.أظهرت الدراسات الحديثة أن فقدان إشارات PI3K-AKT المستندة إلى PDGFα في الفئران يؤدي إلى تشوهات قحفية وجهية، بما في ذلك الحنك المشقوق وعيوب الأنبوب العصبي.ومع ذلك، فإن العلاقة بين مسار PI3K-AKT واستقرار AJ عند التقسيم الطبقي CNCC غير واضحة.
لقد حددنا سابقًا SPECC1L كأول جينة متحورة في شخصين مصابين بشق حاد يمتد من الفم إلى العين، والمعروف باسم الشق المائل (ObFC) أو شق Tessier IV18.تم التعرف على طفرات SPECC1L في عائلتين متعددتي الأجيال مع متلازمة Opitz G/BBB المهيمنة (OMIM #145410)، حيث أظهر الأفراد المصابون فرط المسافة والشفة المشقوقة/الحنك المشقوق، وفي عائلة واحدة مصابة بمتلازمة المسافة الزائدة Tibi (OMIM #145420)20 .أكثر من نصف حالات متلازمة Opitz G/BBB مرتبطة بالصبغي X (OMIM #300000) وتحدث بسبب طفرات في جين MID1، الذي يشفر البروتين 22 من الهيكل العظمي للخلايا المرتبطة بالأنيبيبات الدقيقة.نحن نفترض أن SPECC1L، وهو أيضًا بروتين مرتبط بالأنيبيبات الدقيقة والهيكل الخلوي للأكتين، قد يتوسط في الإشارة المطلوبة لإعادة تشكيل الهيكل الخلوي للأكتين أثناء التصاق الخلايا وهجرتها 18.من خلال الدراسات المختبرية والحيوية، نصف الآن SPECC1L كمنظم جديد لاستقرار AJ من خلال إشارات PI3K-AKT.على المستوى الخلوي، أدى نقص SPECC1L إلى انخفاض في مستوى البروتين الشامل AKT وزيادة في التشتت القمي القاعدي لـ AJ، والذي تم التخلص منه عن طريق التنشيط الكيميائي لمسار AKT.في الجسم الحي، تظهر الأجنة التي تعاني من نقص Specc11 ضعف إغلاق الأنبوب العصبي وانخفاض تشريح CNCC.وبالتالي، يعمل SPECC1L في الإشارات المستندة إلى التصاق الخلايا عالية التنظيم والمطلوبة لوظيفة CNCC الطبيعية أثناء تكوين الوجه.
لتوصيف دور SPECC1L على المستوى الخلوي، استخدمنا خط خلايا ساركوما العظمية المستقر الموصوف مسبقًا والذي يعاني من نقص في SPECC1L18.كان لخلايا U2OS المستقرة ذات الضربة القاضية SPECC1L (kd) انخفاض معتدل (60-70٪) في مستويات نصوص وبروتينات SPECC1L، إلى جانب عيوب في الهجرة وإعادة تنظيم الهيكل الخلوي للأكتين 18. في المقابل، حدث انخفاض عابر شديد في لقد ثبت أن SPECC1L يؤدي إلى عيوب انقسامية 23.بعد مزيد من التوصيف، وجدنا أن خلايانا المستقرة SPECC1L-kd غيرت شكلها بدرجة عالية جدًا من التقاء (الشكل 1).تبدو خلايا التحكم الفردية وخلايا kd عند التقاء منخفض متشابهة (الشكل 1A، D).بعد 24 ساعة من الاندماج، احتفظت خلايا التحكم بشكلها المكعب (الشكل 1B، E)، بينما استطالت خلايا SPECC1L-kd (الشكل 1C، F).تم التقاط مدى هذا التغيير في شكل الخلية عن طريق التصوير الحي في الجسم الحي لخلايا التحكم وخلايا kd (الفيلم 1).لتحديد دور SPECC1L في الخلايا المتموجة، قمنا أولاً بفحص تعبيره.لقد وجدنا أن مستويات البروتين SPECC1L زادت عند الانصهار (الشكل 1G)، في حين لم تزيد مستويات نسخة SPECC1L (الشكل 1H).بالإضافة إلى ذلك، مع زيادة كثافة الخلية، تراكم بروتين SPECC1L عند الحدود بين الخلايا (الشكل 2A-E)، مع نمط متداخل مع نمط β-catenin المرتبط بالغشاء (الشكل 2A'-E').نظرًا لارتباط SPECC1L بالهيكل الخلوي للأكتين 18،23، افترضنا أن SPECC1L يتفاعل مع الوصلات اللاصقة القائمة على الأكتين (AJ).
(AF) تستطيل خلايا ضربة قاضية (DF) SPECC1L عند التقاء عالٍ (F) مقارنةً بخلايا التحكم U2OS (AC).تظهر هنا ثلاث من النقاط الزمنية الست (T1، T3، T6) التي اخترناها لكثافات خلايا مختلفة.(G) تحليل لطخة غربية يُظهر أن بروتين SPECC1L قد استقر عند درجة عالية من التقاء مقارنة بدرجة منخفضة من التقاء في خلايا التحكم.تُظهر اللطخة الغربية لـ SPECC1L النطاق المتوقع البالغ 120 كيلو دالتون ونطاق الوزن الجزيئي الأعلى، وربما تم تعديله بعد الترجمة (*).تم إجراء تحليل لطخة غربية في ظل نفس الظروف للالتقاء المنخفض والعالي.تم التقاط الصور التي تظهر SPECC1L عند التقاء منخفض وعالي من نفس اللطخة.تمت إزالة نفس اللطخة وإعادة فحصها باستخدام الجسم المضاد β-actin.( H ) أظهر التحليل الكمي RT-PCR عدم وجود تغييرات كبيرة في مستويات نسخة SPECC1L.تمثل أشرطة الخطأ SEMs من أربع تجارب مستقلة.
(AE) اخترنا ست نقاط زمنية (T1-T6) تمثل مجموعة من كثافات الخلايا لتطبيع تحليل شكل الخلية وتغييرات AJ في خلايا U2OS مع ضربة قاضية SPECC1L (kd).وشملت الخمس الأولى من هذه النقاط الزمنية خلايا مفردة (T1)، واندماج 50-70٪ من مجموعات الخلايا الصغيرة (T2)، والاندماج دون إعادة تشكيل خلايا kd (T3)، وإعادة تشكيل خلايا kd (T4)، وتغييرات على مدار 24 ساعة.في الشكل الخلفي لخلايا kd (T5).كان البروتين SPECC1L منتشرًا في الغالب في السيتوبلازم عند T1 (A)، ولكن لوحظ تراكمه عند الحدود بين الخلايا في نقاط زمنية لاحقة (B-E، الأسهم).(FJ) يُظهر β-catenin تراكمًا مشابهًا عند الحدود بين الخلايا المرتبطة بمجمع AJ.(A'-E') يُظهر SPECC1L وβ-catenin تلطيخًا متداخلًا عند حدود الخلايا عند كثافة الخلايا العالية (الأسهم).(F'-J') في خلايا SPECC1L-kd، يبدو تلطيخ cat-catenin طبيعيًا عند كثافة الخلية المنخفضة (F'-H')، ولكنه يتوسع مع تغير شكل الخلية (I'، J'؛ أسهم)، مما يشير إلى أن AJ قد تغير.القضبان = 10 ميكرون.
حاولنا بعد ذلك تحديد تأثير نقص SPECC1L على AJ.استخدمنا العديد من العلامات المرتبطة بـ AJ، بما في ذلك المكونات الأساسية F-actin وmyosin IIb وβ-catenin وE-cadherin.زادت ألياف إجهاد الأكتين في خلايا SPECC1L-kd كما هو موضح سابقًا (الشكل 3A، B) 18.أظهر Myosin IIb المرتبط بخيوط الأكتين زيادة مماثلة في خلايا SPECC1L-kd في المختبر (الشكل 3C، D).يرتبط β-catenin المرتبط بـ AJ بالكادهيرين في غشاء الخلية، مما يُظهر نمط تعبير "قرص العسل" الطبيعي في الخلايا المكعبة للتحكم (الشكل 3E، G).ومن المثير للاهتمام ، في الصور المسطحة باستخدام المجهر متحد البؤر ، أظهر تلطيخ cat-catenin (الشكل 3E ، F) و E-cadherin (الشكل 3G ، H) على غشاء الخلية للخلايا الناقصة SPECC1L المتموجة أنماطًا بارزة من تلطيخ ممتد.كان هذا التوسع في تلطيخ cat-catenin المرتبط بـ AJ في خلايا kd أكثر وضوحًا عند التقاء، ولكن يبدو أنه يسبق التغييرات في شكل الخلية (الشكل 2F-J، F'-J').لتحديد الطبيعة الفيزيائية لهذا تلطيخ AJ الممتد، قمنا بفحص حدود الخلايا على السطح القاعدي القمي لخلايا U2OS SPECC1L-kd بواسطة المجهر الإلكتروني للإرسال (TEM) (الشكل 3I، J).على النقيض من خلايا التحكم (الشكل 3I) ، التي تحتوي على مناطق منفصلة كثيفة الإلكترون تشير إلى AJ (الأسهم) ، أظهرت خلايا kd (الشكل 3J) مناطق كبيرة متجاورة ذات كثافة إلكترون عالية تشير إلى AJ على طول المستوى القمي القاعدي..بالإضافة إلى ذلك ، في المقاطع العرضية ، لاحظنا طيات غشاء الخلية واسعة النطاق في خلايا kd (الشكل S1A ، B) ، وهو ما يفسر النمط الممتد لنطاقات تلطيخ cat-catenin و E-cadherin (الشكل 3F ، H).دعماً لدور SPECC1L في AJs، تمت مشاركة β-catenin مع SPECC1L في lysates من خلايا U2OS المتموجة (الشكل 3K).جنبا إلى جنب مع المناعية الموسعة لعلامات AJ، كان تحليل TEM متسقًا مع فرضيتنا القائلة بأن نقص SPECC1L يزيد من كثافة AJ القمي القاعدي والتباين.
(AH) زيادة تلطيخ F-actin في خلايا kd عند 48 ساعة بعد الانصهار (T6؛ A، B).تغيير تلطيخ الميوسين بنك الاستثمار الدولي المرتبط بـ F-actin (C، D).تم تعزيز النمط السلس لتلوين غشاء β-catenin وE-cadherin في خلايا التحكم (E، G) في خلايا SPECC1L-kd (F، H).القضبان = 10 ميكرون.(I – J) صورة مجهرية إلكترونية تراقب الوصلة القمية القاعدية بين الخلايا.تُظهر خلايا التحكم مناطق مميزة كثيفة الإلكترون تشير إلى الوصلات اللزجة (I، الأسهم).في المقابل، ظهر الوصل القمي القاعدي بأكمله في خلايا SPECC1L-kd كثيف الإلكترون (J، الأسهم)، مما يشير إلى زيادة كثافة وتشتت الوصلات اللاصقة.(K) تم تحصين β-catenin مع SPECC1L في lysates خلية U2OS المتموجة.صورة مأخوذة من مكان واحد تمثل واحدة من أربع تجارب مستقلة.
لفهم دور SPECC1L في التشكل القحفي الوجهي، قمنا بإنشاء نموذج فأر يعاني من نقص Specc1l باستخدام خطين مستقلين من خلايا مصيدة ES، DTM096 وRRH048 (BayGenomics، CA)، والتي تمثل نسخ intron 1 وSpecc1l تم التقاطها عند 15 (الشكل 1). .4A، الشكل S2).تم تحديد الموقع الجينومي لإدراج ناقلات الشرك من خلال تسلسل الجينوم الكامل وتأكيده بواسطة PCR (الشكل S2).سمح كلا تصميمي مصيدة الجينات أيضًا بدمج مراسلي Specc11-lacZ داخل الإطار عند التقاطهم.لذلك، تم استخدام تعبير lacZ الذي يحدده تلطيخ X-gal كمؤشر للتعبير Specc11.أظهر كلا الأليلين أنماط تعبير lacZ متشابهة، حيث تظهر مصيدة الجينات DTM096 في الإنترون 1 تعبيرًا أقوى من RRH048 في الإنترون 15 (غير موضح).ومع ذلك، يتم التعبير عن Specc1l على نطاق واسع، مع تعبير قوي بشكل خاص في الطيات العصبية عند E8.5 (الشكل 4B)، وفي الأنبوب العصبي وعمليات الوجه عند E9.5 وE10.5 (الشكل 4C، D)، وفي الأطراف النامية. في E10.5 والعيون (الشكل 4D).لقد أبلغنا سابقًا أن تعبير SPECC1L في القوس البلعومي الأول عند E10.5 كان موجودًا في الظهارة واللحمة المتوسطة الأساسية 18، ​​بما يتوافق مع نسب CNCC.لاختبار التعبير SPECC1L في CNCC، أجرينا E8.5 الطيات العصبية (الشكل 4E-J) وأقسام الجمجمة E9.5 (الشكل 4K-).في E8.5، الطيات العصبية الملطخة SPECC1L بشكل مكثف (الشكل 4E، H)، بما في ذلك الخلايا الملطخة بعلامات NCC (الشكل 4G، J).في E9.5، SPECC1L (الشكل 4K، N) ملطخ بقوة CNCC المهاجر ملطخ بـ AP2A (الشكل 4L، M) أو SOX10 (الشكل 4O، P).
(أ) تمثيل تخطيطي لجين Specc11 الخاص بالماوس والذي يُظهر إدخال ناقل شرك في استنساخ الخلايا ES DTM096 (intron 1) وRRH048 (intron 15).(BD) تلطيخ lacZ لأجنة Specc1lDTM096 غير المتجانسة التي تمثل تعبير Specc1l من E8.5 إلى E10.5.NE = الأديم الظاهر العصبي، NF = الطية العصبية، PA1 = القوس البلعومي الأول.(EP) المناعي SPECC1L مع علامات NCC AP2A وSOX10 في الطيات العصبية E8.5 (NF؛ EJ) وأقسام الجمجمة E9.5 (KP).وقد لوحظ على نطاق واسع تلطيخ SPECC1L في الطيات العصبية E8.5 (E، H؛ رؤوس الأسهم)، بما في ذلك الخلايا المسماة بـ AP2A (F، G؛ رؤوس الأسهم) وSOX10 (I، J؛ رؤوس الأسهم).في E9.5، SPECC1L ملطخ بقوة CNCCs المهاجرة (K، N؛ السهام) المسمى AP2A (L، M؛ السهام) وSOX10 (O، P؛ السهام).
يُظهر التهجين بين الفئران متغايرة الزيجوت Specc1lDTM096/+ وSpecc1lRRH048/+ أن أليلات مصيدة الجينات ليست متكاملة وأن متغاير الزيجوت المركب ومتماثلات الزيجوت الجنينية لأي أليل مصيدة الجينات هي قاتلة جنينية (الجدول S1).أشارت النسب المندلية إلى انخفاض في معدل بقاء الزيجوت المتغايرة عند الولادة (المتوقع 1.34 مقابل 2.0).لاحظنا انخفاض معدل الوفيات في الفترة المحيطة بالولادة بين متغايري الزيجوت، وكان بعضهم يعاني من تشوهات قحفية وجهية (الشكل S3).ومع ذلك، فإن الاختراق المنخفض لهذه الأنماط القحفية الوجهية في الفترة المحيطة بالولادة يجعل من الصعب دراسة آلياتها الفيزيولوجية المرضية الأساسية.لذلك، ركزنا على النمط الظاهري الجنيني المميت لطفرات Specc11 المتماثلة.
لم تتطور معظم الأجنة الطافرة المركبة متغايرة الزيجوت أو متجانسة Specc1lDTM096/RRH048 بعد E9.5-10.5 (الأشكال 5A-D)، ولم يغلق الأنبوب العصبي من الأمام (الأشكال 5B، D) وأحيانًا يُغلق من الخلف (غير موضح) ..وارتبط هذا العيب في إغلاق الأنبوب العصبي القحفي مع غالبية CNCC التي تحمل علامة DLX2 المتبقية في الطيات العصبية عند E10.5، مما يشير إلى عدم وجود تشريح (الشكل 5A'-D').لتحديد ما إذا كان الحجم الإجمالي لـ CNCC قد تم تقليله أيضًا، قمنا بوضع علامة على خطوط CNCC مع GFP في خطوط مصيدة الجينات لدينا مع Wnt1-Cre وROSAmTmG.نقوم بفرز GFP+ NCC وGFP- (RFP+) غير NCC من أجنة كاملة.في E9.5، لم تتغير نسبة CNCCs المسمى GFP المصنفة بالتدفق بشكل ملحوظ بين WT والأجنة الطافرة (غير موضحة)، مما يشير إلى مواصفات CNCC العادية.لذلك، افترضنا أن تلطيخ Wnt1-Cre وDLX2 المتبقي في الطيات العصبية المكشوفة (الشكل 5B') كان بسبب طبقات CNCC المعيبة، ربما بسبب زيادة كثافة أو تشتت خلايا AJ، كما يظهر في خلايا SPECC1L-kd.استخدمنا علامات NCC SOX10 وAP2A وDLX2 لتأكيد وجود CNCC في الطية العصبية (الشكل 5E-R).في E8.5، لوحظ تلطيخ الطية العصبية لجميع علامات NCC الثلاثة في أقسام WT (الشكل 5E، G، I) ومتحولة Specc1l (الشكل 5F، H، J).في E9.5، في حين أن علامات NCC ملطخة NCC المهاجرة في أقسام WT (الشكل 5M، O، Q)، لوحظ تلطيخ NCC المتبقي في الطيات العصبية المكشوفة للأجنة المتحولة Specc1l (الشكل 5N، P، R).نظرًا لأن SOX10 وDLX2 يشيران إلى CNCCs المهاجرة، فإن هذه النتيجة تشير إلى أن CNCCs الناقصة لـ SPECC1L تحقق مواصفات ما بعد الترحيل ولكنها تفشل في الهجرة من الطيات العصبية.
يؤدي نقص Specc11 إلى خلل في إغلاق الأنبوب العصبي، وانفصال خلايا العرف العصبي القحفي وخلايا AJs.
(A، B') E9.5 WT (A) جنين يحمل خلايا القمة العصبية القحفية المهاجرة (CNCC) المسمى بـ Wnt1-Cre (A').في المقابل، تظهر الأجنة الطافرة Specc11 طيات عصبية مفتوحة (B)، ورؤوس سهام) وCNCCs لم تهاجر (B'، رؤوس سهام).(C، D') الصور الميدانية الساطعة (C، D') والمناعية (C'، D') من علامة CNCC DLX2 للأجنة E10.5 WT (C، C') وSpectc1l (D، D').في أجنة WT E10.5، يستعمر CNCC الإيجابي لـ DLX2 الأقواس الخيشومية (C'، السهام)، بينما في المسوخ، يستمر تلطيخ واضح في الطيات العصبية المفتوحة (D'، السهام) وفي الأقواس البلعومية الأولى (D'، السهام).) مع بعض تلطيخ (الأسهم) التي تشير إلى سوء التصفيح وهجرة CNCC.ER) تمت تسمية أقسام الأجنة الطافرة WT وSpecc1l في المراحل E8.5 (E – L) وE9.5 (M – R) بعلامات NCC SOX10 (E، F، M، N)، AP2A (G، H، O، P ) وDLX2 (I، J، Q، R).في E8.5، لوحظ تلطيخ NCC في الطية العصبية من النوع البري (NF) والأقسام المتحولة.كشف تلطيخ SOX10 و cat-catenin في E8.5 WT (K) والطفرة (L) عن زيادة تلطيخ β-catenin عند حدود الخلايا في الطيات العصبية.في E9.5، لوحظ تلطيخ من النوع البري لـ CNCCs المهاجرة (M، O، Q)، بينما في المسوخات، تلطخ CNCCs غير الطبقية الطيات العصبية المفتوحة (N، P، R).(S – Z) تحليل العلامات في الجسم الحي AJ في الأقسام الإكليلية من أجنة WT و Specc11DTM096 / RRH048 مع طفرة E9.5.يظهر مستوى مقطعي تقريبي في الزاوية اليمنى العليا.في أقسام الأنسجة الطافرة، لوحظ زيادة تلطيخ F-actin (S، T) وmyosin IIb (U، V).على غرار النتائج المختبرية في الشكل 3، في الأجنة الطافرة، لوحظ تلطيخ الغشاء المعزز لـ β-catenin (W، X) وE-cadherin (Y، Z).(AA-BB) صورة مجهرية إلكترونية لقسم من جنين من النوع البري يتطلع إلى ما وراء حدود الخلية القميية القاعدية تُظهر منطقة مميزة كثيفة الإلكترونات تشير إلى الوصلات اللاصقة (AA، الأسهم).على النقيض من ذلك، في أقسام الأجنة الطافرة Specc11 (BB، الأسهم)، تكون الوصلة القاعدية بأكملها كثيفة الإلكترون، مما يشير إلى زيادة كثافة وتشتت الوصلات اللاصقة.
لاختبار فرضيتنا القائلة بأن انخفاض الطبقات يرجع إلى تغيير AJ، قمنا بفحص وضع العلامات AJ في الطيات العصبية المكشوفة للأجنة المتحولة Specc1l (الشكل 5S-Z).لاحظنا زيادة في ألياف الإجهاد الأكتين (الشكل 5S، T) وما يصاحب ذلك من زيادة توطين تلطيخ الميوسين IIB على ألياف الأكتين (الشكل 5U، V).الأهم من ذلك أننا لاحظنا زيادة تلطيخ cat-catenin (الشكل 5W، X) وE-cadherin (الشكل 5Y، Z) عند الحدود بين الخلايا.قمنا أيضًا بفحص تلطيخ cat-catenin لـ NCC في الطيات العصبية للأجنة E8.5 (الشكل 5K، L).يبدو أن تلطيخ cat-catenin أقوى في الطيات العصبية الطافرة Specc1l (الشكل 5L وK)، مما يشير إلى أن تغييرات AJ قد بدأت.في صورة مجهرية إلكترونية لأقسام جمجمة أجنة E9.5، لاحظنا مرة أخرى زيادة تلطيخ كثيف الإلكترون منتشر في أجنة Specc1l المتحولة مقارنة بـ WT (الشكل 5AA وBB وS1E-H).مجتمعة ، تدعم هذه النتائج نتائجنا المختبرية في خلايا SPECC1L-kd U2OS وتشير إلى أن تلطيخ AJ الشاذ يسبق التقسيم الطبقي CNCC في أجنةنا الطافرة.
نظرًا للعلاقة العدائية المعروفة بين نشاط AKT واستقرار E-cadherin ، افترضنا تورط إشارات PI3K-AKT.بالإضافة إلى ذلك، لاحظنا وجود تقرحات تحت البشرة في بعض أجنةنا الطافرة التي نجت من الوفاة (<5٪) عند E9.5-10.5 واستقرت بدلاً من ذلك عند حوالي E13.5 (الشكل S3).تعد الحويصلات تحت الجلد سمة مميزة لإشارات PI3K-AKT المنخفضة بناءً على PDGFRα12.فانتوزو وآخرون.(2014) أفاد أن تعطيل تنشيط PI3K المستند إلى PDGFRα في الأجنة الطافرة PdgfraPI3K/PI3K يؤدي إلى ظهور حويصلات تحت البشرة، وعيوب الأنبوب العصبي، وأنماط ظاهرية من الحنك المشقوق.في الواقع، تم تخفيض مستويات عموم AKT وSer473-AKT المفسفرة النشطة في الجسم الحي في الأنسجة الطافرة Specc1l إلى الاعتقال الجنيني E9.5 (الشكل 6A-D).قد يكون الانخفاض في مستويات الفسفرة Ser473-AKT ناتجًا بالكامل عن انخفاض مستويات عموم AKT في الجسم الحي (الشكل 6E) وفي المختبر (الشكل 6F).ولوحظ انخفاض في المختبر فقط عندما كانت خلايا U2OS متموجة بقوة مع التغيرات في شكل الخلية وكثافة AJ (الشكل 6D).وبالتالي، تشير بياناتنا إلى أن SPECC1L هو منظم إيجابي جديد لإشارات PI3K-AKT في التشكل القحفي الوجهي.
(A – E) أقسام الجمجمة E8.5 (A، B) و E9.5 (C، D) أو E9.5 ليسات من أجنة Specc1l المتحولة (E) تظهر مستويات S473-AKT الفسفورية النشطة وتقليل بروتين عموم AKT ، مقارنة بالسيطرة WT.تم إجراء النشاف الغربي على ليساتيس من النوع البري وليساتيس متحولة في ظل نفس الظروف.تم التقاط الصور المعروضة لـ SPECC1L من وصمة عار واحدة.تمت إزالة نفس اللطخة وإعادة فحصها باستخدام الأجسام المضادة لـ Pan-ACT و act-actin.تم تخفيض مستويات Pan-AKT في الطيات العصبية E8.5 (A، B) ومستويات S473-AKT المفسفرة في أقسام الجمجمة E9.5 بشكل ملحوظ.( F ) تم تخفيض مستويات Pan-AKT بالمثل في خلايا SPECC1L-kd U2OS التي تم حصادها عند التقاء عالٍ.تمثل أشرطة الخطأ SEMs من ثلاثة تقديرات كمية لطخة غربية مستقلة.(GJ) أقسام أجنة WT عند E9.5 ملطخة بـ KI67 وcaspase 3 المشقوق، على التوالي، مما يدل على تكاثر الخلايا (G، G') والقليل من نشاط موت الخلايا المبرمج (H، H').تُظهر الأجنة الطافرة Specc11 تكاثرًا مشابهًا للخلايا (I)، لكن عدد الخلايا التي تخضع لموت الخلايا المبرمج يزداد بشكل ملحوظ (J).
قمنا بعد ذلك بفحص علامات الانتشار وموت الخلايا المبرمج.لم نلاحظ أي اختلاف في تكاثر أجنة E9.5 (الشكل 6E، G مقارنة بـ I) مع مؤشر انتشار قدره 82.5% لطفرات WT و86.5% لطفرات Specc1l المقاسة بتلطيخ KI67 (P <0.56، Fisher's اختبار دقيق).وبالمثل، لم نلاحظ أي اختلاف في موت الخلايا المبرمج الذي تم قياسه عن طريق تلطيخ كاسباس 3 المشقوق في الطيات العصبية عند E8.5 حتى اعتقال الجنين (غير موضح) (غير موضح).في المقابل، تم زيادة موت الخلايا المبرمج بشكل ملحوظ في جميع الأجنة الطافرة E9.5 (الشكل 6F وH وJ).تتوافق هذه الزيادة الإجمالية في موت الخلايا المبرمج مع انخفاض إشارات PI3K-AKT والفتك الجنيني المبكر .
بعد ذلك، لتأكيد الدور السببي لإشارة PI3K-AKT في تغييرات AJ في خلايا kd لدينا، قمنا كيميائيًا بتغيير المسار في خلايا التحكم وخلايا kd (الشكل 7A-F).استخدمنا كعلامة النمط الظاهري لتغيير شكل الخلية الذي لوحظ في خلايا SPECC1L-kd المتموجة، والذي قمنا بتحديده باستخدام نسبة البعد الأطول (الطول) إلى البعد الرأسي المقابل (العرض).ومن المتوقع أن تكون نسبة 1 للخلايا المستديرة أو المكعبة نسبيا (الشكل 7G).بالإضافة إلى شكل الخلية، أكدنا أيضًا التأثير على AJ عن طريق تلطيخ β-catenin (الشكل 7A'-F').كان تثبيط مسار PI3K-AKT باستخدام الورتمانين كافياً لتغيير شكل الخلية في خلايا التحكم (الشكل 7A، C) وAJ (الشكل 7A').لم يؤثر منشط PI3K-AKT SC-79 على شكل الخلية (الشكل 7A، E) أو توسعة AJ (الشكل 7A') في خلايا التحكم.في خلايا SPECC1L-kd، أدى المزيد من قمع مسار PI3K-AKT إلى زيادة موت الخلايا المبرمج (الشكل 7B، D) وزيادة ملحوظة في تلطيخ cat-catenin (الشكل 7B')، بما يتوافق مع الطفرات الثقيلة في الجسم الحي.الأهم من ذلك، أن تنشيط مسار PI3K-AKT أدى إلى تحسن كبير في شكل الخلية (الشكل 7B، F) والأنماط الظاهرية AJ (الشكل 7B").تم قياس التغيرات في شكل الخلية كنسبة استدارة الخلية (CCR) ومقارنتها من حيث الأهمية كما هو موضح أعلاه (الشكل 7G).في الواقع، في خلايا التحكم (الشكل 7G، CCR = 1.56)، كان العلاج بالورتمانين كافيًا لتغيير شكل الخلية بشكل ملحوظ (الشكل 7G، CCR = 3.61، p <2.4 × 10-9) إلى الحد المماثل لتلك الملاحظة في SPECC1L.خلايا -kd (الشكل 7G، CCR = 3.46).لم يكن علاج Wortmannin لخلايا SPECC1L-kd (الشكل 7G، CCR = 3.60، لا يكاد يذكر) أكثر أهمية من خلايا kd غير المعالجة (الشكل 7G، CCR = 3.46، لا يكاد يذكر) أو خلايا التحكم المعالجة بالورتمانين (الشكل 7G).، CCR = 3.46، لا يكاد يذكر) يؤثر بالإضافة إلى ذلك على استطالة الخلية (7G، CCR = 3.61، لا يكاد يذكر).الأهم من ذلك هو أن منشط SC-79 AKT استعاد النمط الظاهري المطول لخلايا SPECC1L-kd (الشكل 7G، CCR = 1.74، p <6.2 × 10-12).تؤكد هذه النتائج أن SPECC1L ينظم إشارات PI3K-AKT وتشير إلى أن الانخفاض المعتدل في SPECC1L يؤثر على التصاق الخلايا، في حين يؤدي النقصان القوي إلى موت الخلايا المبرمج (الشكل 8).
(A – F ') خلايا التحكم (A، C، E) وSPECC1L-kd (B، D، F) المعالجة بمثبط مسار PI3K-AKT wortmannin (C، D) أو منشط SC-79 (E، F) تكون خلايا التحكم غير المعالجة مكعبة (A) مع تلطيخ خلوي طبيعي لـ β-cat (A')، بينما تكون خلايا kd ممدودة (B) مع زيادة تلطيخ β-cat (B').بعد قمع مسار PI3K-AKT، استطالت خلايا التحكم (C) مع توسع β-cat (C')، بينما بدأت خلايا kd في الخضوع لموت الخلايا المبرمج (D)، على غرار أجنةنا شديدة الطفرة وتظهر β-cat محسنة للغاية.تلطيخ (د ').بعد تنشيط مسار PI3K-AKT، ظلت خلايا التحكم مكعبة (E) ولها تلطيخ طبيعي β-cat (E')، بينما أظهرت الخلايا kd تحسنًا ملحوظًا في شكل الخلية (F) وتلطيخ β-cat (F')، مما يشير إلى (G) تم قياس درجة تغير شكل الخلية في (AF) باستخدام نسبة استدارة الخلية (CCR) للبعد الأطول (الطول) والبعد الرأسي المقابل (العرض) باستخدام برنامج MetaMorph.كانت خلايا SPECC1L-kd غير المعالجة (NT) (CCR = 3.46) أطول بكثير من خلايا التحكم (CCR = 1.56، p <6.1 × 10–13).كان تثبيط نقيع الشعير لمسار PI3K-AKT في خلايا التحكم كافياً لإحداث استطالة مماثلة في شكل الخلية (CCR=3.61، p<2.4×10-9).وبالمثل، أدى تنشيط AKT بواسطة SC-79 في خلايا SPECC1L-kd إلى استعادة استطالة الخلية للتحكم في المستويات (CCR = 1.74، p <6.2 × 10–12).أدى علاج Wortmannin لخلايا SPECC1L-kd إلى زيادة موت الخلايا المبرمج ولكن لم تحدث زيادة أخرى في تغير شكل الخلية (CCR = 3.60) مقارنةً بالـ kd غير المعالجة (CCR = 3.46، ns) أو خلايا التحكم المعالجة بالـ wortmannin (3.61) التي لوحظت في .ns = لا يهم.+/- تظهر قياسات SEM لـ 50 خلية.تم حساب الاختلافات الإحصائية باستخدام اختبار الطالب.
(أ) تمثيل تخطيطي لتثبيط وتفعيل مسار PI3K-AKT مما يؤدي إلى تغييرات AJ وإنقاذه، على التوالي.(ب) النموذج المقترح لتثبيت بروتين AKT بواسطة SPECC1L.
تتطلب CNCCs ما قبل الهجرة تحلل AJ للفصل عن الخلايا الظهارية العصبية الأمامية 1،15،32.زيادة تلطيخ مكونات AJ وفقدان التوزيع غير المتماثل AJ القمي القاعدي في الخلايا التي تعاني من نقص SPECC1L سواء في المختبر أو في الجسم الحي، جنبًا إلى جنب مع القرب المادي لـ SPECC1L من cat-catenin، يشير إلى أن SPECC1L يعمل على الحفاظ بشكل صحيح على الاستقرار المحلي لـ AJ عضلات التنظيم.الهيكل الخلوي الأكتين.إن ارتباط SPECC1L مع الهيكل الخلوي للأكتين و cat-catenin والزيادة في عدد خيوط الأكتين المكثفة في غياب SPECC1L يتوافق مع الزيادة الملحوظة في كثافة AJ.الاحتمال الآخر هو أن زيادة عدد ألياف الأكتين في الخلايا التي تعاني من نقص SPECC1L يؤدي إلى تغير في التوتر بين الخلايا.نظرًا لأن الإجهاد الخلوي يؤثر على ديناميكيات AJ 33، فإن تغيرات الجهد يمكن أن تؤدي إلى انتشار AJ 34 بشكل أكبر.لذا فإن أي تغييرات ستؤثر على طبقات CNCC.
يتم التعبير عن Wnt1 في الطيات العصبية المبكرة التي تؤدي إلى ظهور خلايا القمة العصبية.وبالتالي، فإن تتبع نسب Wnt1-cre يمثل كلاً من NCC35 قبل والهجرة.ومع ذلك، Wnt1 يمثل أيضًا استنساخ أنسجة المخ الظهرية المستمدة أيضًا من الطيات العصبية المبكرة 35،36، مما يجعل من المحتمل أن تلطيخ طفرات E9.5 لعلامات Wnt1 في الطيات العصبية المفتوحة ليس CNCC.أكد تلطيخنا الإيجابي لعلامات NCC AP2A وSOX10 أن الطيات العصبية المكشوفة للأجنة الطافرة Specc11 تحتوي بالفعل على CNCC.بالإضافة إلى ذلك، نظرًا لأن AP2A وSOX10 هما علامات للهجرة المبكرة لـ NCC، أشار تلطيخ إيجابي إلى أن هذه الخلايا هي CNCC بعد الهجرة ولا يمكن تقسيمها إلى طبقات بواسطة E9.5.
تشير بياناتنا إلى أن التنظيم الجزيئي لـ AJ بواسطة SPECC1L يتم بوساطة إشارات PI3K-AKT.يتم تقليل إشارات AKT في الخلايا والأنسجة الناقصة لـ SPECC1L.النتائج التي توصل إليها Fantauzzo وآخرون.دعم الدور المباشر لإشارة PI3K-AKT في التشكل القحفي الوجهي.(2014) أظهر أن عدم تنشيط إشارات PI3K-AKT المستندة إلى PDGFRα يؤدي إلى النمط الظاهري للحنك المشقوق.نظهر أيضًا أن تثبيط مسار PI3K-AKT يكفي لتغيير AJ وشكل الخلية في خلايا U2OS.تمشيا مع النتائج التي توصلنا إليها، قايين وآخرون.أظهر الشكل 37 أن تقليل تنظيم الوحدة الفرعية PI3K α110 في الخلايا البطانية يؤدي إلى زيادة مماثلة في تلطيخ الكاتينين المحيط بالخلية، والذي يشار إليه على أنه زيادة في "مؤشر الاتصال".ومع ذلك، في الخلايا البطانية التي تكون خيوط الأكتين منظمة للغاية بالفعل، يؤدي قمع مسار PI3K-AKT إلى شكل خلية فضفاضة.في المقابل، أظهرت خلايا SPECC1L-kd U2OS شكل خلية ممدود.قد يكون هذا الاختلاف خاصًا بنوع الخلية.في حين أن قمع إشارات PI3K-AKT يؤثر بشكل دائم على الهيكل الخلوي للأكتين، يتم تحديد التأثير على شكل الخلية من خلال التغيرات في التوتر الناجم عن التغيرات في كثافة وتنظيم ألياف الأكتين المركزية.في خلايا U2OS، استخدمنا فقط تغييرات شكل الخلية كعلامة لتغيير AJ الناقص في SPECC1L واستعادته.في الختام، نحن نفترض أن تثبيط مسار AKT في نقص SPECC1L يزيد من استقرار AJ ويقلل التصفيح في CNCC.
ومن المثير للاهتمام، أنه تم تخفيض مستويات AKT الشاملة في المختبر وفي الجسم الحي بالإضافة إلى مستويات 473-AKT المفسفرة في غياب SPECC1L، مما يشير إلى تنظيم إشارات PI3K-AKT على مستوى استقرار بروتين AKT أو دورانه.تقوم جينات SPECC1L وMID1، المرتبطة بمتلازمة Opitz/GBBB، بتشفير البروتينات التي تعمل على تثبيت الأنابيب الدقيقة 18،22.الآلية التي من خلالها يتوسط SPECC1L وMID1 في تثبيت الأنابيب الدقيقة ليست مفهومة تمامًا.في حالة SPECC1L، يتضمن هذا التثبيت أستلة معززة لمجموعة فرعية من الأنابيب الدقيقة 18.من الممكن أن يستخدم SPECC1L آلية مماثلة لتثبيت البروتينات الأخرى مثل AKT.لقد ثبت أن أستلة بقايا الليسين في بروتين AKT يؤدي إلى انخفاض في توطين الغشاء والفسفرة .بالإضافة إلى ذلك، مطلوب تواجد سلسلة K63 في نفس بقايا الليسين على AKT لتوطين الغشاء وتنشيطه.من بين العديد من العوامل التي تتفاعل مع بروتينات SPECC1L التي تم تحديدها في العديد من الشاشات الهجينة ذات الإنتاجية العالية للخميرة، أربعة - CCDC841، ECM2942، APC وUBE2I43 - متورطة في معدل دوران البروتين أو استقراره عبر التواجد في كل مكان أو sumoylation.قد يشارك SPECC1L في التعديل اللاحق للترجمة لبقايا ليسين AKT، مما يؤثر على استقرار AKT.ومع ذلك، فإن الدور الحاسم لـ SPECC1L في توطين واستقرار بروتين AKT لا يزال يتعين توضيحه.
أدت العيوب الشديدة في تعبير SPECC1L في الجسم الحي إلى زيادة تلطيخ علامة AJ وتراكب CNCC المعيب، بالإضافة إلى زيادة موت الخلايا المبرمج والفتك الجنيني المبكر.أظهرت التقارير السابقة أن طفرات الفأر ذات المستويات المتزايدة من موت الخلايا المبرمج ترتبط بعيوب الأنبوب العصبي 44،45،46،47 والعيوب القحفية الوجهية .وقد اقترح أن موت الخلايا المفرط في الطيات العصبية أو الأقواس البلعومية قد يؤدي إلى عدم كفاية عدد الخلايا المطلوبة للحركة المورفولوجية المناسبة 48،49،50.في المقابل، أظهرت خطوط الخلايا الناقصة SPECC1L لدينا مع انخفاض معتدل في تعبير SPECC1L تغيرات AJ فقط دون دليل على زيادة موت الخلايا.ومع ذلك، فإن التثبيط الكيميائي لمسار PI3K-AKT في خلايا Kd هذه أدى إلى زيادة موت الخلايا المبرمج.وبالتالي، فإن الانخفاض المعتدل في تعبير أو وظيفة SPECC1L يضمن بقاء الخلية.وهذا يتفق مع ملاحظة أن الأجنة الطافرة Specc11 النادرة التي تفلت من الاعتقال في الحادي والعشرين.E9.5 - ربما بسبب انخفاض كفاءة التقاط الجينات - قادرون على إغلاق أنابيبهم العصبية والتوقف لاحقًا في التطور، غالبًا مع عيوب قحفية وجهية (الشكل S3).ويتفق أيضًا مع هذا أيضًا ندرة حدوث أجنة Specc1l متغايرة الزيجوت مع تشوهات قحفية وجهية - ربما بسبب زيادة كفاءة التقاط الجينات - بالإضافة إلى اكتشاف الزرد حيث يتسبب أحد تقويمي SPECC1L (specc1lb) في ظهور أنماط ظاهرية جنينية متأخرة، بما في ذلك فقدان الفكين السفليين والشقوق الثنائية51.وبالتالي، فإن طفرات فقدان الوظيفة غير المتجانسة SPECC1L التي تم تحديدها في المرضى البشر قد تسبب إعاقات صغيرة في وظيفة SPECC1L أثناء التشكل القحفي الوجهي، وهو ما يكفي لشرح الشقوق الفموية الوجهية.قد يلعب التنظيم القائم على SPECC1L للاتصالات بين الخلايا أيضًا دورًا في تكوين الحنك واندماج الأقواس البلعومية.ستساعد الدراسات الإضافية لوظيفة SPECC1L في توضيح دور الاتصالات المؤقتة بين الخلايا في CNCC أثناء إغلاق الأنبوب العصبي في حركية الخلايا الظهارية العصبية والتشكل القحفي الوجهي.
تم وصف التحكم في الساركوما العظمية U2OS وخلايا SPECC1L-kd مسبقًا (سعدي وآخرون ، 2011).تم أيضًا تمييز الأجسام المضادة ضد SPECC1L سابقًا (سعدي وآخرون، 2011).الأجسام المضادة لـ cat-catenin (أرنب؛ 1:1000؛ سانتا كروز، دالاس، تكساس) (الماوس؛ 1:1000؛ تقنية تشوير الخلايا، Danvers، MA)، myosin IIb (1:1000؛ Sigma-Aldrich، St. Louis) ) ، MO)))، E-cadherin (1:1000؛ أبكام، كامبريدج، ماساتشوستس)، AP2A (1:1000؛ نوفوس بيولوجيكس، ليتلتون، كولورادو)، SOX10 (1:1000؛ 1000؛ أفيفا سيستمز بيولوجيا، سان دييغو) ، كاليفورنيا)، DLX2 (1:1000؛ أبكام، كامبريدج، ماساتشوستس)، phospho-Ser473-AKT (1:1000؛ تكنولوجيا تشوير الخلايا، Danvers، MA)، pan-AKT (1:1000؛ ThermoFisher Scientific، Waltham، MA) ) ، KI67 (1: 1000؛ تقنية تشوير الخلية، Danvers، MA)، caspase 3 المشقوق (1: 1000؛ تقنية تشوير الخلية، Danvers، MA) و act-actin (1: 2500؛ Sigma-Aldrich، St. Louis، MO ) كما هو موضح ..كانت خيوط الأكتين ملطخة باستخدام Acti-stain rhodamine phalloidin (الهيكل الخلوي، دنفر، كولورادو).
تم استزراع خلايا التحكم U2OS وخلايا SPECC1L-kd في DMEM عالي الجلوكوز القياسي مع 10٪ من مصل الأبقار الجنيني (Life Technologies، Carlsbad، CA).بالنسبة للتغييرات AJ، تم زرع 2 × 10 خلايا على الزجاج المعالج بجيلاتين الخنازير بنسبة 0.1٪ (Sigma-Aldrich، St. Louis، MO) وتم ملاحظة التغيرات في شكل الخلية.تم جمع الخلايا في نقاط زمنية مختلفة محددة: 4 ساعات بعد البذر (t = 1)، بعد 24 ساعة من البذر (t = 2)، التقاء دون تغيير في شكل الخلية (t = 3)، تغير في شكل الخلية (t = 4) ، 24 ساعة بعد تغيير شكل الخلية (t = 5) و 48 ساعة بعد تغيير شكل الخلية (t = 6) (الشكل 1، 2، 3).لتعديل مسار PI3K-AKT، تم استزراع الخلايا عند التركيزات المشار إليها باستخدام مثبط PI3K-AKT wortmannin (TOCRIS Biosciences، Minneapolis، Minnesota) أو منشط SC-79 (TOCRIS Biosciences، Minneapolis Adams، Minnesota).تم تغيير الوسط الذي يحتوي على المواد الكيميائية يوميًا.
تم إجراء تسجيلات إطارًا بإطار على التحكم المباشر وخلايا KD في ظل ظروف الثقافة الطبيعية، وتم جمع صور تباين الطور كل 10 دقائق لمدة 7 أيام.تم الحصول على الصور باستخدام مجهر مقلوب Leica DM IRB يتم التحكم فيه بواسطة الكمبيوتر ومجهز بمرحلة ميكانيكية وهدف 10 × N-PLAN متصل بكاميرا QImaging Retiga-SRV.أثناء التصوير، تم الحفاظ على ثقافات الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو رطب مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
تم استخدام خطين من خلايا ES لمصيدة الجينات DTM096 وRRH048 من المركز الإقليمي لموارد الفئران المتحولة (UC Davis، CA) لإنشاء خطوط الماوس الناقصة Specc11، المعينة Specc1lgtDTM096 وSpecc1lgtRRH046.باختصار، تم حقن 129/REJ ES الخلايا في الكيسة الأريمية C57BL6.تم تربية الفئران الذكور الخيمرية الناتجة مع فئران C57BL6 الأنثوية للتعرف على النسل مع تلوين معطف Agouti.تم استخدام وجود إدراجات ناقلات مصيدة الجينات لتحديد الزيجوت المتغايرة.تم الاحتفاظ بالفئران على خلفية مختلطة من 129/REJ;C57BL6.تم تأكيد موقع موقع الإدراج لناقل المصيدة الجينية بواسطة RT-PCR، وتسلسل الجينوم، والتكامل الجيني (الشكل التكميلي 1).لتتبع نسب CNCC للفئران Specc1lGT المزدوجة غير المتجانسة، تم عبور الفئران ROSAmTmG (#007576) وWnt1-Cre (#003829) (Jackson Laboratory، Bar Harbour، ME) لإنتاج أليل ROSAmTmG وWnt1-Cre في أجنة Specc1l المتحولة.تم إجراء جميع التجارب على الفئران وفقًا للبروتوكولات التي وافقت عليها لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية التابعة للمركز الطبي بجامعة كانساس.
تم تثبيت الأجنة في (1٪ فورمالدهايد، 0.2٪ جلوتارالدهيد، 2 مم MgCl2، 0.02٪ NP-40، 5 مم EGTA) لمدة 60 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة.بعد التثبيت في محلول تلطيخ X-gal (5 ملم فيريسيانيد البوتاسيوم، 5 ملم فيروسيانيد البوتاسيوم، 2 ملم MgCl2، 0.01٪ ديوكسيكولات الصوديوم، 0.02٪ NP-40، 1 ملغ / مل X-gal) تم إجراء تطوير وصمة عار عند 37 درجة مئوية .درجة مئوية خلال 1-6 ساعات.وكانت الأجنة بعد ثابتة في 4٪ PFA وتصور.
بالنسبة للنشاف الغربي، تم التخلص من الخلايا في محلول تحلل سلبي (Promega، Fitchburg، WI) مُستكمل بمزيج من مثبطات الأنزيم البروتيني HALT (Sigma-Aldrich، St. Louis، MO).تمت معالجة Lysates على 12٪ من المواد الهلامية الجاهزة من مادة بولي أكريلاميد Mini-PROTEAN TGX (Bio-Rad، Hercules، CA) وتم نقلها إلى أغشية Immobilon PVDF (EMD Millipore، Billerica، MA).تم حظر الأغشية في 5٪ حليب في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1٪ توين.تم تحضين الأجسام المضادة طوال الليل عند 4 درجات مئوية أو لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.تم استخدام كاشف Femto SuperSignal West ECL (Thermo Scientific، Waltham، MA) لتوليد الإشارات.من أجل تلطيخ المناعة، تم إصلاح الأجنة بين عشية وضحاها في 4٪ PFA / PBS وحفظها بالتبريد.تم حظر عمليات تجميد الأنسجة في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ من مصل الماعز الطبيعي (Thermo Scientific، Waltham، MA) و 0.1٪ Triton X-100 (Sigma-Aldrich، St. Louis، MO) ثم تم حضنها عند 4 درجات مئوية في حاضنة أثناء ليلة.مع الأجسام المضادة والأجسام المضادة الثانوية الفلورسنت (1: 1000) لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية.تم وضع المقاطع الملطخة في وسط الذهب ProLong (Thermo Scientific، Waltham MA) وتم الحصول على صور مسطحة باستخدام مجهر متحد البؤر Leica TCS SPE.تم إجراء كل تلطيخ مناعي كثلاث تجارب مستقلة على تقاطعات لاثنين على الأقل من الأجنة الطافرة.وتظهر تجربة تمثيلية.
تم تحضين الخلايا في المخزن المؤقت RIPA المعدل (20 ملي مولار Tris-HCl ، الرقم الهيدروجيني 8.0 ، 1٪ NP-40 ، 130 ملي كلوريد الصوديوم ، 10٪ جلسرين ، 2 ملي مولار EDTA ، ومثبط الأنزيم البروتيني HALT (Sigma-Aldrich، St. Louis، MO) باختصار ، تمت تنقية المحللات باستخدام حبات مغناطيسية من البروتين G (Life Technologies، Carlsbad، CA) ثم تم احتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية باستخدام حبات بروتين G المضادة لـ SPECC1L أو IgG لاستخراج SPECC1L وتم إجراء النشاف الغربي باستخدام المضاد. الأجسام المضادة -β-catenin الموصوفة أعلاه تمثل تجارب IP المشترك الموضحة أربع تجارب مستقلة.
تم توفير الخلايا المستنبتة الثابتة أو الأنسجة الجنينية الفأرية إلى مركز المجهر الإلكتروني في المركز الطبي بجامعة كانساس.باختصار، تم دمج العينات في راتينج EMbed 812 (Electron Microscopy Sciences، Fort Washington، PA)، وتم بلمرها طوال الليل عند درجة حرارة 60 درجة مئوية، وتم تقطيعها عند 80 نانومتر باستخدام مشراح Leica UC7 الفائق الصغر المجهز بشفرة ماسية.تم تصور المقاطع باستخدام مجهر إلكتروني JEOL JEM-1400 مزود بمسدس Lab6 بقوة 100 كيلو فولت.
كيفية الاستشهاد بهذه المقالة : Wilson، NR et al.يؤدي نقص SPECC1L إلى زيادة ثبات المفاصل المقسمة وتقليل تفتيت خلايا العرف العصبي القحفي.العلم.6, 17735;دوى:10.1038/srep17735 (2016).
سان جين، ج.-ب.تحريض وتمايز القمة العصبية.(سبرينجر ساينس + بيزنس ميديا؛ Landes Bioscience/Eurekah.com، 2006).
كورديرو، الدكتور وآخرون.خلايا القمة العصبية القحفية المتحركة: دورها في تطور القحفي الوجهي.المجلة الأمريكية لعلم الوراثة الطبية.الجزء أ 155 أ، 270-279، دوى:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland، RP Neurocristopathia: نموها وتطورها على مدار 20 عامًا.طبيب الأطفال.علم الأمراض.معمل.الدواء.17، 1-25 (1997).
Mangold E.، Ludwig KU وNoten MM اختراق في علم الوراثة للشقوق الفموية الوجهية.الاتجاهات في الطب الجزيئي 17، 725-733، دوى:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu، M. and Riley، FM الآليات الجزيئية لهجرة خلايا القمة العصبية القحفية وتنميطها أثناء تطور القحفي الوجهي.التنمية 137، 2605-2621، دوى: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon، MJ، Marazita، ML، Beaty، TH and Murray، JK Cleft lip and palate: فهم التأثيرات الوراثية والبيئية.تعليق طبيعي.علم الوراثة 12، 167-178، دوى: 10.1038 / nrg2933 (2011).
انجرام، سي آر وآخرون.التشكل غير الطبيعي للجلد والأطراف والمنطقة القحفية الوجهية في الفئران التي تعاني من نقص عامل تنظيم الإنترفيرون -6 (Irf6).جينيت الوطنية.38، 1335-1340، دوى: 10.1038 / ng1903 (2006).
بيرارد جانفيد، M. وآخرون.الطفرات السائدة في GRHL3 تسبب متلازمة فان دير وورد وتضعف نمو الأدمة المحيطة بالفم.آم جي هوم جينيت 94، 23-32، دوى: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris، MJ and Juriloff، DM قم بتحديث قائمة طفرات الفأر التي تحتوي على عيوب في إغلاق الأنبوب العصبي والتقدم نحو الفهم الجيني الكامل لإغلاق الأنبوب العصبي.التحقيق في العيوب الخلقية.الجزء أ، علم التشوهات السريري والجزيئي 88، 653-669، دوى: 10.1002/bdra.20676 (2010).
تنظم إشارات Fantauzzo، KA & Soriano، P. PI3K بوساطة PDGFRalpha البقاء والتكاثر في تطور الهيكل العظمي من خلال مسار داخل الخلايا يعتمد على p53.تطوير الجينات 28، 1005-1017، دوى: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp، AJ، Green، ND and Murdoch، JN Disheveled: علاقة التوسع المتقارب بإغلاق الأنبوب العصبي.الاتجاهات في علم الأعصاب.26، 453–455، دوى: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).