347 مكون كيميائي للأنابيب الملفوفة من الفولاذ المقاوم للصدأ، تحديد بروتينات مستضد كريات الدم البيضاء البشرية A (HLA-A) الجديدة المستجيبة للفيروسات باستخدام قياس الطيف الكتلي المتقاطع (CLMS)

شكرا لكم لزيارة Nature.com.أنت تستخدم إصدار متصفح مع دعم محدود لـ CSS.للحصول على أفضل تجربة، نوصي باستخدام متصفح محدث (أو تعطيل وضع التوافق في Internet Explorer).بالإضافة إلى ذلك، ولضمان الدعم المستمر، نعرض الموقع بدون أنماط وجافا سكريبت.
أشرطة التمرير تعرض ثلاث مقالات لكل شريحة.استخدم زري الرجوع والتالي للتنقل عبر الشرائح، أو أزرار التحكم في الشرائح الموجودة في النهاية للتنقل خلال كل شريحة.

وصف المنتج

أنابيب لفائف الفولاذ المقاوم للصدأ 347L، درجة الفولاذ: SS347L

يستحث نظام إشارات الإنترفيرون استجابة خلوية قوية لمجموعة واسعة من الإشارات المرضية المسببة للأمراض والجوهرية من البيئة، مما يؤدي إلى تحريض مجموعات فرعية من البروتينات المحفزة للإنترفيرون.قمنا بتطبيق قياس الطيف الكتلي عبر الارتباط (CLMS) بوساطة DSS للكشف عن تفاعلات البروتين البروتين الجديدة في مجال البروتينات التي يسببها الإنترفيرون.بالإضافة إلى البروتينات المتوقعة المحفزة للإنترفيرون، حددنا أيضًا منتجات جديدة مترابطة بين الجزيئات وداخل الجزيئات من البروتينات المحفزة للإنترفيرون مثل MX1، وUSP18، وOAS3، وSTAT1.ركزنا على التحقق المتعامد من مجموعة جديدة من شبكات البروتين المحفزة للفيروسات والتي شكلتها بروتينات HLA-A (H2BFS-HLA-A-HMGA1) باستخدام الهطول المناعي المشترك ودراستها الإضافية باستخدام نمذجة الديناميكيات الجزيئية.كشفت نمذجة الديناميكيات التوافقية لمجمع البروتين عن العديد من مواقع التفاعل التي تعكس التفاعلات المحددة في نتائج CLMS.معًا، نقدم دراسة تجريبية لـ CLMS لتحديد مجمعات الإشارات الجديدة الناجمة عن الإنترفيرون، ونتطلع إلى الاستخدام الأوسع لـ CLMS لتحديد ديناميكيات جديدة لتفاعلات البروتين في البيئة الدقيقة للورم.
قبل أن تبدأ الاستجابة المناعية التكيفية، يقوم نظام الدفاع الفطري للمضيف بتكوين استجابة مضادة للميكروبات بوساطة عائلة من السيتوكينات ألفا الحلزونية المفرزة تسمى الإنترفيرون (IFNs).تعمل فئتا IFN من النوع I IFNα وIFNβ على تنشيط الاستجابات الخلوية، بما في ذلك الحالات المضادة للفيروسات، وproapoptotic، والالتهابية، ومضادة التكاثر.في البشر، هناك 13 نوعًا فرعيًا من IFNα معروفة، جميعها متجمعة على الكروموسوم 91. والمثير للدهشة أنه تمت دراسة IFNα2 فقط للاستخدام السريري.في الآونة الأخيرة، تم إيلاء اهتمام خاص للبحث عن أنواع فرعية أخرى من IFNα.أظهرت دراسة حديثة أن IFNα14 هو أحد الأشكال الإسوية الأكثر فعالية في تقييد تكرار HBV2 وHIV-13,4 مقارنة بالنوع الفرعي IFNα2 الكنسي.
لقد ثبت أن مجمعات مستقبلات الإنترفيرون من النوع الأول (IFNAR1 وIFNAR2) تؤدي إلى سلسلة من نقل الإشارة بوساطة كينازات يانوس TYK2 وJAK15,6.تعمل محولات إشارات يانوس كيناز الفوسفوريلات ومنشطات البروتين النسخي (STAT1 وSTAT2) على بقايا التيروزين لبدء عملية التغاير المتغاير بوساطة مجال SH2.بعد ذلك، يقوم IRF9 بربط الثنائيات المتغايرة STAT لتشكيل مركب ثلاثي من جين العامل 3 المحفز بالإنترفيرون (ISGF3)، والذي ينتقل إلى النواة ويحفز نسخ أكثر من 2000 جينة محفزة بالإنترفيرون (ISGs) 5،6،7،8.
تشكل ISGs العمود الفقري لجهاز المناعة الفطري، وخاصة في الاستجابة للهجوم الفيروسي.باعتبارها خط الدفاع الأول ضد العدوى الفيروسية، تنشر الخلايا بسرعة تفاعلات واسعة النطاق من البروتينات الخلوية مع مجموعة واسعة من الأنشطة البيولوجية.تتضمن هذه البروتينات مستقبلات التعرف على الأنماط، وجزيئات الإشارة، وعوامل النسخ، والبروتينات ذات الوظائف المباشرة المضادة للفيروسات، بالإضافة إلى المنظمات السلبية للاستجابات المناعية9.تأتي الكثير من المعلومات حول نشاط ISG من الشاشات الوظيفية التي تستخدم شاشات الإفراط في التعبير 10،11 أو تقنيات إسكات الجينات (siRNA وRNAi وCRISPR) 12،13 حيث يتم التعبير عن ISGs الفردية أو تثبيطها ويتم اختبار نشاطها على فيروسات مختلفة.على الرغم من أن هذه الدراسات قد حددت الخصائص المضادة للفيروسات لمجموعات ISG الفردية، إلا أن الآليات الجزيئية الأساسية لكل مجموعة ISG تظل غير معروفة إلى حد كبير.من المقبول عمومًا أن العديد من البروتينات تتفاعل مع واحد أو أكثر من السيتوكينات لضمان النشاط الكامل، لذلك إما أن تتفاعل ISGs بشكل مباشر أو أن تفاعلاتها تتم بوساطة البروتينات الخلوية.على سبيل المثال، حددت دراسة حديثة للبروتينات الضوئية الارتباط ATPase VCP/p97 كشريك تفاعل رئيسي لـ IFITM3، والذي يؤدي تثبيطه إلى عيوب في الفرز الليزوزومي، والدوران، والنقل المشترك لـ IFITM3 مع الجزيئات الفيروسية 14.باستخدام الترسيب المناعي، حددنا VAPA، وهو بروتين مرتبط بالحويصلة، كشريك تفاعل مع IFITM1/2/3 الذي يتوسط النضج الفيروسي بوساطة الكوليسترول، وقد تم تأكيد ذلك من خلال دراسة أخرى باستخدام نظام خميرة ثنائي الهجين.الدعم العلمي 15 , 16 .
إحدى العمليات البيولوجية الأساسية التي تشارك في قمع العدوى والتحول الخبيث هي عرض المستضد، والذي يتم بوساطة جزيئات معقدة التوافق النسيجي الرئيسية (MHC).يتم تحميل الببتيدات (8-12 من الأحماض الأمينية الطويلة) من البروتينات المشقوقة أو المنتهية قبل الأوان أو المطوية بشكل غير صحيح في مغاير MHC-I (يتكون من سلاسل MHC-I الثقيلة والخفيفة، تسمى β-2-microglobulin؛ β2M) 17،18.يتم نقل أدوات القطع MHC-I المستقرة الناتجة إلى سطح الخلية، حيث تقدم الببتيدات داخل الخلايا إلى خلايا CD8 + T (خلايا T السامة للخلايا) 17.تتعرف الخلايا التائية على مسببات الأمراض والخلايا التي تحمل مستضدًا خاصًا بالورم وتدمرها.ونتيجة لذلك، غالبًا ما تقوم مسببات الأمراض والخلايا السرطانية بقمع عملية تقديم المستضد لتجنب المراقبة المناعية.بالإضافة إلى ذلك، يتم ضبط MHC-I في 40-90% من الأورام البشرية وغالبًا ما يرتبط بتشخيص أسوأ.
يجب على الجينات المشاركة في الاستجابة لمسببات الأمراض أن تنتقل بسرعة بين حالة السكون وحالة النسخ النشط.لذلك، من المفترض أن تشارك العديد من البروتينات الخلوية في الاستجابة لارتفاع الطلب على الإنترفيرون خلال فترات قصيرة من الزمن، بما في ذلك إعادة عرض وتعديل الكروماتين المروج 20،21.ركزت معظم الدراسات على تحديد شركاء بروتين ISG الفرديين في وجود الإنترفيرون.أوضحت العديد من الدراسات البروتينية والنسخية في أنظمة الخلايا النموذجية تأثير IFN على المشهد الخلوي.ومع ذلك، على الرغم من الفهم المتزايد للديناميكيات التي تحدثها الإنترفيرونات، إلا أننا لا نزال نعرف القليل عن تورط مجموعات ISG.عند النظر في تعقيد وديناميكيات إشارات الإنترفيرون التي تعتمد على الوقت، ينشأ سؤالان: (1) هل من الممكن تثبيت مجمعات البروتينات المتعددة المشاركة في الإشارات السريعة واحتجازها، و(2) هل يمكن تعيين هذه التفاعلات في مساحة ثلاثية الأبعاد؟
لمعالجة هذه المشكلات، قمنا بتنفيذ الارتباط الكيميائي المتبادل بوساطة ديسوكسينيميد (DSS) إلى جانب قياس الطيف الكتلي (CLMS) لدراسة شبكة تفاعل البروتين الناجم عن IFNα وديناميكياتها.يضيف DSS روابط تساهمية بين المخلفات القريبة من البروتينات و/أو مجمعات البروتين في الجسم الحي.يكشف تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد اللاحق عن مواقع تشابك محددة تعكس القرب المكاني للمناطق داخل بروتين معين، تسمى الروابط الداخلية، أو الوحدات الفرعية في مجمعات البروتين، تسمى العلاقات المتبادلة.باستخدام هذا النهج، حددنا العديد من مجمعات البروتين البروتينية الجديدة بالإضافة إلى شبكات التفاعل متعددة البروتينات الناجمة عن الإنترفيرون.من خلال إجراء مزيد من الاختبار لمجموعة فرعية من هذه التفاعلات الجديدة، نثبت أن H2BFS (H2B histone-type FS؛ يشار إليه فيما يلي باسم H2B) وMDN1 يعملان كشركاء ملزمين لـ HLA-A.
تعد خلايا Flo-1 واحدة من أشهر النماذج المختبرية لسرطان المريء الغدي لأنها تحاكي السمات الرئيسية لأورام المريء .ومع ذلك، ليست كل الأورام مناعية، ولتحديد ما إذا كانت خلايا Flo-1 تستجيب للعلاج بالإنترفيرون، قمنا بمعالجة خلايا Flo-1 بـ 10 نانوغرام/مل من IFNα لمدة 72 ساعة.أظهرت خلايا Flo-1 الحث المبكر لـ pSTAT1 وIRF1، بدءًا من ساعتين بعد العلاج واستمر لمدة 72 ساعة، مع انخفاض يعتمد على الوقت في المستويات الثابتة لـ IRF1 (الشكل 1A).تم العثور على ISGs (MX1، IFITM1، OAS1/2، وISG15) مستحثة بقوة بعد 6 ساعات، لمحاكاة استجابات المرحلة المتوسطة والمتأخرة الكلاسيكية لـ IFNα (الشكل 1A).وتشير هذه البيانات مجتمعة إلى أنه يمكن استخدام هذا النموذج الخلوي لدراسة استجابات الإنترفيرون.
استجابات التعبير البروتيني التفاضلي في خلايا Flo-1 بعد علاج IFNα.(أ) تم تحليل تعبير البروتين في خلايا Flo-1 المعالجة بـ 10 نانوغرام / مل من IFNα لمدة 2 و6 و24 و48 و72 ساعة بواسطة كتلة مناعية باستخدام الأجسام المضادة ISG المشار إليها.(ب) المواد الهلامية SDS-PAGE الملون باللون الأزرق من مستخلصات الخلايا الكاملة بعد الارتباط المتبادل مع DSS للأوقات والتركيزات المحددة.(ج) تم فحص الكتلة المناعية التمثيلية باستخدام الجسم المضاد p53(DO-1) من نفس العينات لتقييم درجة الارتباط المتبادل للبروتين.
لالتقاط مشهد تفاعل البروتين في الموقع، استخدمنا DSS، وهو عامل ربط متقاطع يستخدم على نطاق واسع نظرًا لنفاذية الغشاء العالية ووقت التفاعل القصير نسبيًا.يساعد وقت التفاعل الأقصر على منع تكوين مجاميع كبيرة من البروتينات المتشابكة، وبالتالي الحفاظ على استقرار الرابط المتشابك.لتحديد تركيز DSS الأمثل وتجنب الإفراط في التشابك، قمنا أولاً بتعريض الخلايا إلى 5 و2.5 و1 مم DSS لمدة 5 و10 و5 و30 دقيقة على التوالي، وقمنا بتحليل المحللات بواسطة SDS-PAGE الملطخة بـ Coomassie (البيانات غير ظاهرة) .يبدو أن lysates الخلية مترابطة بشكل كبير عند أدنى تركيز وفي أقصر نقطة زمنية.ولذلك، تم معاير DSS إلى 1، 0.5، و 0.1 ملم على مدى 5 دقائق (الشكل 1B).وقد لوحظ التشابك الأمثل مع 0.5 ملي مولار DSS لمدة 5 دقائق، وتم اختيار هذه الظروف للخلايا المعالجة بـ IFNα.بالإضافة إلى ذلك، يُظهر الشكل 1C لطخة غربية يتم إجراؤها باستخدام الجسم المضاد p53 (DO-1) لتقييم درجة الارتباط المتبادل للبروتين.
تمت معالجة خلايا Flo-1 بـ 10 نانوغرام / مل من IFNα لمدة 24 ساعة قبل إضافة الرابط المتشابك.تم بعد ذلك تحلل الخلايا المتصالبة عن طريق التحلل البروتيني في خطوتين وتمت معالجة البروتينات بواسطة FASP (الشكل 2)24،25.تم تحليل الببتيدات التربتية المتقاطعة بواسطة قياس الطيف الكتلي (الشكل 2).تتم بعد ذلك مطابقة أطياف MS/MS مع تسلسل البروتين وقياسها كمياً باستخدام MaxQuant26,27.تم التعرف على الببتيدات المتقاطعة من الأطياف التي تم الحصول عليها باستخدام برنامج SIM-XL، وتم دمج المركبات الفردية في شبكة معقدة باستخدام خطوط أنابيب برامج الحوسبة مفتوحة المصدر xQuest28 وSIM-XL29 (الشكل 2).يحدد SIM-XL تفاعلات البروتين والبروتين والسلاسل الداخلية والسلاسل الفردية في مخاليط البروتين البسيطة أو المعقدة ويوفر نصوصًا لتصور التفاعلات في هياكل البروتين.بالإضافة إلى ذلك، فإنه يصنف كل إسناد ترافقي كدرجة تعريف وفقًا لجودة الطيف MS/MS29.تم تحديد العديد من تفاعلات ومجمعات البروتين والبروتين الموثوقة للغاية، وتمت دراسة مجموعة جديدة من التفاعلات بشكل أكبر باستخدام الهطول المناعي المشترك والتغيرات التوافقية للمجمعات باستخدام نمذجة الديناميكيات الجزيئية (MD) (الشكل 2) 30، 31.
نظرة عامة تخطيطية على طريقة CLMS.تمت معالجة خلايا Flo-1 بـ 10 نانوغرام/مل من IFNα لمدة 24 ساعة يليها الارتباط المتبادل للبروتين في الموقع باستخدام DSS متبوعًا بتحلل الخلايا والتريبسين.تم تحليل العينات المترابطة باستخدام مطياف الكتلة Orbitrap وأخذ عينات أخرى لتجزئة سلائف الببتيد أثناء LC-MS/MS.تم التعرف على اثنين من الببتيدات المرتبطة من الأطياف التي تم الحصول عليها باستخدام برنامج آلة التعرف على الطيف الخاصة ببرنامج الببتيدات المتشابكة (SIM-XL)، وتم دمج جميع المركبات في شبكة معقدة باستخدام خطوط الأنابيب الحسابية.قم بتصفية التفاعلات منخفضة الثقة بناءً على درجات المعدل الإيجابي الخاطئ (FDR).تم تأكيد العديد من التفاعلات الجديدة عالية الدقة بين البروتين والبروتين باستخدام الهطول المناعي المشترك، وتم فحص التغييرات التوافقية في المجمعات باستخدام نمذجة الديناميكيات الجزيئية (MD).
تم اكتشاف ما مجموعه ~ 30500 و ~ 28500 ببتيد باستخدام MaxQuant في عينات IFNα غير المحفزة والمحفزة، على التوالي (الجدول التكميلي S1، الشكل 3A).أظهر توزيع طول الببتيد في كلتا الحالتين نسبة أعلى من الببتيدات الأكبر حجمًا، مما يشير إلى وجود الببتيدات المتصالبة (الشكل 3 ب، ج).بالإضافة إلى ذلك، كانت هناك نسبة أكبر من الببتيدات الأكبر حجمًا في نطاق 40-55 في العينات المعالجة بـ IFNα (الشكل 3C).أظهر رسم خرائط البروتين ضد كثافة log2 أن البروتينات الكلاسيكية المحفزة بالإنترفيرون كانت الأكثر وفرة مقارنة بالعينات غير المعالجة، بما في ذلك MX1 وIFIT1/3 وOAS2/3 وDDX58 وHLA-F (الشكل ثلاثي الأبعاد).أظهر تحليل مسارات البروتينات المخصبة بأكثر من ثلاثة أضعاف استجابةً لعلاج IFNα باستخدام قاعدة بيانات مسار Reactome أن عرض المستضد ومعالجته بوساطة MHC-I كان المسار الأكثر شيوعًا (الشكل 3E).تمشيا مع التقارير السابقة، كانت الاستجابات المضادة للفيروسات بوساطة OAS وISG15 وكذلك إشارات IFNα/β وcytokine من بين المسارات التي تم تنشيطها.بالإضافة إلى ذلك، تم تحديد الروابط المتقاطعة للبروتين الخاصة بالليسين والسيرين من أطياف MS/MS المكتسبة أصلاً باستخدام SIM-XL.أفادت دراسة حديثة عن 104 مجموعات ISG تغطي 20 فيروسًا من 9 فئات من الفيروسات عن طريق التحليل التلوي لدراسات التعبير الزائد لـ ISG الفردية في 5 أنواع من الخلايا9.ومع ذلك، للتغلب على القيود الحسابية لفحص مجموعات البيانات الكبيرة، بدأنا بمجموعة بيانات أصغر لاستكشاف التفاعلات المحتملة بين قائمة جينات IRDS التي أبلغ عنها Padaria et al.، ومعظمها عبارة عن ISGs.
تحديد البروتينات المترابطة المعبر عنها تفاضليًا استجابةً لـ IFNα (البيانات التي تم الحصول عليها من MaxQuant).(أ) مخطط فين الذي يمثل عدد الببتيدات الشائعة والحصرية المحددة في عينات Flo-1 المعالجة وغير المعالجة لـ IFNα14.توزيع طول الببتيد للعينات المتشابكة غير المعالجة (B) والمعالجة بـ IFNα (C).(D) خريطة الحرارة التي تمثل log2 (كثافة LFQ) بين خلايا Flo-1 غير المعالجة وخلايا IFNα14 المعالجة.تُظهر اللوحة اليسرى البروتينات الأكثر نشاطًا في وجود IFNα.(E) رسم بياني يمثل مسارات التخصيب الرئيسية العشرين بعد علاج IFNα.قامت قاعدة بيانات مسار Reactome بتحليل أكثر من أربعة أضعاف التغييرات في البروتينات المنتظمة المستجيبة لـ IFNα.
إن تحفيز ISG بوساطة الإنترفيرون موثق جيدًا، ولكن على المستوى الجزيئي، ليس من المفهوم جيدًا كيف تبلغ هذه البروتينات ذروتها في مجموعة واسعة من الوظائف البيولوجية.لقد قمنا بالتحقق من تفاعلات البروتين بدرجة عالية من الثقة بين ISGs المعروفة.ومن المثير للاهتمام أننا حددنا شبكة تتضمن بروتينات MX1 وUSP18 وROBO1 وOAS3 وSTAT1 التي تشكل مجمعًا كبيرًا استجابةً لعلاج IFNα (الشكل 4، الجدول S2) 32،33،34.والأهم من ذلك، أنه تم العثور على هذه التفاعلات في جميع النسخ الثلاث التي عولجت بـ IFNα ولم يتم العثور عليها في العينات غير المعالجة، مما يشير إلى أنها تشكلت على وجه التحديد استجابة لعلاج IFNα.من المعروف أن STAT1 ينظم بشكل نسبي التعبير عن هذه ISGs، ولكن لم تتم دراسة تفاعلها مع ISGs على مستوى البروتين.أظهر التركيب البلوري لـ STAT1 أن مجاله الحلزوني (CCD) لا يشارك في التفاعل مع الحمض النووي أو البروتومرات أثناء تكوين الثنائيات .تشكل حلزونات ألفا هذه بنية حلزونية توفر مساحة سطحية محبة للماء في الغالب لحدوث التفاعلات 35.في بيانات CLMS الخاصة بنا، لاحظنا أن معظم التفاعلات مع STAT1 حدثت في مجال SH2 الذي يسبق CCD، أو مجال الرابط، أو ذيل المحطة C (البقايا 700-708) (الشكل 4A).ذكرت دراسة سابقة أن USP18 يرتبط بمجال ربط CCD والحمض النووي (DBD) لـ STAT2 ويتم تجنيده في الوحدة الفرعية لمستقبلات الإنترفيرون من النوع الأول IFNAR2 للتوسط في تثبيط إشارات الإنترفيرون من النوع الأول 24.أظهرت بياناتنا أيضًا أن المجال التحفيزي USP18 يتفاعل مع STAT1 DBD (الشكل 4A، D)، مما يشير إلى أن كلا من STAT1 وSTAT2 قد يلعبان دورًا في جذب USP18 إلى IFNAR2.
تم تحديد شبكة ISG البروتينية في الخلايا المترابطة المعالجة بـ IFNα.(أ) مؤامرة تفاعل ثنائية الأبعاد تُظهر تفاعلات البروتين والبروتين (التي تم إنشاؤها في برنامج SIM-XL)، مع خطوط تمثل التفاعلات بين الجزيئات (تم ضبط قطع الارتباط التشعبي على 3.5).يتم تمييز المجالات ذات الهويات المختلفة بألوانها: مجال MX1، وDynamin_N (73–249)، وDynamin_M (259–547)، وGED (569–660).مجالات OAS3: OAS1_C (160-344)، OAS1_C (559-745)، NTP_transf_2 (780-872)، وOAS1_C (903-108).المجال ROBO1، Ig_3 (67–151)، I-set (170–258)، I-set (262–347)، Ig_3 (350–432)، Ig_3 (454–529)، fn3 (562–646)، fn3 (678-758) وfn3 (777-864).حقول STAT1: STAT_int (2–120)، STAT_alpha (143–309)، STAT_bind (321–458)، SH2 (573–657)، وSTAT1_TAZ2bind (715–739).(ب) عارض دائري للبروتينات المترابطة (MX1، UBP18، OAS3، ROBO1، وSTAT1) مع التفاعلات والتفاعلات المسمى باللون الأزرق والأحمر، على التوالي.تم تعيين عتبة الارتباط المتبادل عند 3.5.تشير مخططات النقاط إلى مواقع تفاعل STAT1 مع MX1 (C)، وUSP18 (D)، وROBO1 (E)، وOAS3 (F)، بالإضافة إلى مواقع تفاعل K أو S بين الببتيدين.في الشكل، تم تعيين عتبة نقاط الارتباط المتبادل على 3.0.(G) مواقع التفاعل المختلفة بين مجالات STAT1 وOAS3 DI المتراكبة على هياكل البروتين الخاصة بها في PyMol (نظام الرسومات الجزيئية PyMOL، الإصدار 2.0 Schrödinger، LLC.)؛STAT1 (معرف pdb: 1bf533) وOAS3 (معرف pdb: 4s3n34).) برنامج.
تم وصف اثنين من الأشكال الإسوية لـ USP18 في البشر، وهو بروتين كامل الطول يوجد في الغالب في النواة، وشكل إسوي بدون مجال طرفي N، USP18-sf، والذي يتم توزيعه بالتساوي في السيتوبلازم والنواة 36 .بالإضافة إلى ذلك، كان من المتوقع أن يكون الطرف N غير منظم ولا يتطلب نشاط الأيزوبيبتيداز أو ربط ISG1537.معظم التفاعلات المحددة في دراستنا كانت موجودة في الطرف N للبروتين، مما يشير إلى أن هذه التفاعلات تشمل USP18 كامل الطول (الشكل 4A، D) وبالتالي من المحتمل أن تحدث في النواة.علاوة على ذلك، تشير بياناتنا أيضًا إلى أن الطرف N متخصص في تفاعلات البروتين مع البروتين.يقع موقع الربط IFNAR2 بين المخلفات 312-368، وعلى وجه الخصوص، لا يرتبط أي من البروتينات الموجودة في المجمع بهذه المنطقة (الشكل 4A) 37،38.تشير هذه البيانات مجتمعة إلى أن مجال ربط IFNAR2 يُستخدم حصريًا بواسطة بروتين المستقبل.بالإضافة إلى ذلك، تم العثور على OAS3 وROBO1 فقط مرتبطين بالنطاقات العليا لموقع الربط N-terminus وIFNAR2 (الشكل 4A).
ينتمي ROBO1 إلى فصيلة الغلوبولين المناعي (Ig) الفائقة من جزيئات الإشارة عبر الغشاء ويتكون من خمسة مجالات Ig وثلاثة مجالات فيبرونكتين (Fn) في المنطقة خارج الخلية.تتبع هذه المجالات خارج الخلية منطقة غشاء قريبة وحلزون واحد عبر الغشاء 39. تقع المنطقة غير المنظمة داخل الخلايا في الطرف C وتحتوي على نماذج متسلسلة محفوظة تتوسط ربط بروتين المستجيب .المنطقة الممتدة من الأحماض الأمينية ~ 1100 إلى 1600 هي في الغالب مضطربة.لقد وجدنا أن MX1 يتفاعل مع ROBO1 من خلال Ig وFn والمجالات داخل الخلايا، بينما تحدث معظم التفاعلات مع STAT1 بين CCD ومجال الرابط والمحطة C لـ ROBO1 (الشكل 4A، E).من ناحية أخرى، تم توزيع التفاعلات مع مناطق رابط DI وDIII وOAS3 في جميع أنحاء بروتين ROBO1 (الشكل 4A).
تقبل عائلة بروتين سينسيز أوليجوادينيلات (OAS) وتربط الحمض النووي الريبوزي RNA مزدوج الجديلة داخل الخلايا (dsRNA)، وتخضع لتغيرات تكوينية، وتقوم بتصنيع قليلات قليلات القلائل المرتبطة بـ 2'،5′ (2-5 As) 40.وقد وجد أنه من بين OASs الثلاثة، OAS3 يظهر أعلى تقارب للرنا المزدوج الجديلة ويجمع أقل كمية من 2-5 As، والتي يمكن تنشيط RNase L وبالتالي الحد من تكاثر الفيروس 41.تتكون عائلة OAS من نطاقات ترانسفيراز النوكليوتيدات الشبيهة بالبوليميريز بيتا (pol-β).أظهرت الأبحاث السابقة أن النشاط التحفيزي للمجال الطرفي C (DIII) يعتمد على مجال ربط الرنا المزدوج الجديلة (DI)، وهو مطلوب لتنشيط OAS342.لاحظنا أن المجالات DI وDII من OAS3 تتفاعل مع CCD ومنطقة تقاطع صغيرة بين SH2 وSTAT1 TAD (الشكل 4A، F).كشف تراكب مواقع التشابك المختلفة على بنية البروتين عن وجود تفاعل بين حلقة β-sheet وDBD STAT1 وجيب مفتوح أو تجويف يتكون من بقايا 60-75 في مجال DI الخاص بـ OAS3 (الشكل 4G).أشار اتجاه البروتينات في المجمع أيضًا إلى أن أيًا من التفاعلات مع OAS3 يتداخل مع قدرة ربط الحمض النووي لمجال DI الخاص به (الشكل S1A).بالإضافة إلى ذلك، يتفاعل مجال N-terminal الخاص بـ GTPase MX1 على نطاق واسع مع نطاقات DI وDIII الخاصة بـ OAS3 (الشكل 4A).لاحظنا أيضًا تفاعلًا بين OAS1 وMX1 في جميع التكرارات الثلاثة المعالجة بـ IFNα، حيث تفاعل مجال OAS1 واحد (نشط أيضًا تحفيزيًا) مع جميع مجالات MX1 الثلاثة (الشكل S2A، B).
تعد بروتينات MX جزءًا من عائلة كبيرة من GTPases الشبيهة بالداينين ​​والتي تحتوي على مجال GTPase N-terminal الذي يربط ويتحلل GTP، وهو مجال وسيط يتوسط التجميع الذاتي، وسحاب leucine طرفي C يعمل بمثابة GTPase (LZ). ).المجال المؤثر المجال25,43.يرتبط MX1 بوحدات فرعية من البوليميرات الفيروسية لمنع نسخ الجين الفيروسي .أظهرت شاشة الخميرة ثنائية الهجين التي تم الإبلاغ عنها مسبقًا أن MX1 المرتبط بـ PIAS1 يمنع تنشيط الجينات بوساطة STAT1 عن طريق منع نشاط ربط الحمض النووي ولديه أيضًا نشاط SUMO E344،45 ligase.هنا، نوضح أن MX1 يرتبط بـ STAT1 (الشكل 4C، D)، ولكن كيف يؤثر هذا التفاعل على تنشيط الجينات بوساطة STAT1 استجابةً لـ IFNα يحتاج إلى مزيد من الدراسة.بالإضافة إلى ذلك، وجدنا أيضًا أن MX1 تفاعل مع IFIT3 وDDX60 في جميع التكرارات الثلاثة المعالجة بـ IFNα (الشكل S2C).
DDX60 عبارة عن مروحية سيتوبلازمية يسببها IFN والتي تم الإبلاغ عنها سابقًا أنها تلعب دورًا في التدهور المستقل لـ RIG-I لـ RNA46 الفيروسي.إنه يتفاعل مع RIG-I وينشط إشاراته بطريقة خاصة بالترابط 46. يتكون DDX60 من مجال هيليكاز DEXD / H-Box ومجال هيليكاز C- الطرفي الذي يربط الحمض النووي الريبي (RNA) الفيروسي و DNA47.تحدث معظم تفاعلاتها مع MX1 وIFIT3 داخل مناطق N- وC الطويلة بدون مجالات أو أشكال أساسية (الشكل S2E، F).ومع ذلك، يرتبط MX1 أيضًا بمجال طائرات الهليكوبتر DEXD/H-Box (الشكل S2E).تحتوي بروتينات عائلة IFIT على نسخ ترادفية من شكل حلزوني مميز يسمى تكرار رباعي الببتيد (TPR).تم العثور على IFIT3 ليكون مُعدِّلًا إيجابيًا لإشارة RIG-I وبالتالي أحد مكونات مجمع MAVS.تشير بياناتنا مجتمعة إلى أن IFIT3 وDDX60 يتفاعلان بشكل أساسي في المنطقة الواقعة بين TPR 3–6 لـ IFIT3 وقد يلعبان دورًا في تشوير RIG-I/MAVS (الشكل S2F).
نظرًا لأن فحص البروتين بأكمله يتطلب جهدًا حاسوبيًا مكثفًا، فقد قمنا بعد ذلك بفحص قاعدة بيانات UniProt البشرية بأكملها بحثًا عن وجود أحد التكرارات المعالجة بـ IFNα.في هذه النسخة المتماثلة، وجدنا العديد من شبكات التفاعل الموثوقة للغاية لـ HLA-A.أظهر تحليل مسارات البروتين التي تم تحديدها بواسطة أطياف MS/MS أن معالجة وعرض المستضد القائم على MHC-I هو المسار الرئيسي الناجم عن الإنترفيرون (الشكل ثلاثي الأبعاد).ولذلك، ركزنا على دراسة التفاعلات البروتينية لجزيئات MHC-I بدرجة عالية من الثقة في جميع العينات المترابطة.يتكون HLA من نطاقات α1 وα2 وα3 وسلاسل خفيفة، والجلوبيولين الميكروي β2 (β2m) عبارة عن بروتين مرافق ثابت.بمجرد تجميعها في الشبكة الإندوبلازمية، تصبح HLA غير مستقرة في غياب بروابط الببتيد.يتكون أخدود ربط الببتيد من نطاقات α1 وα2 متعددة الأشكال وغير منظمة للغاية في شكل غير ببتيد ومجال α351 الأقل تعدد الأشكال نسبيًا.في وجود IFNα، اكتشفنا مجمعين HLA-A: أحدهما يتفاعل مع HMGA1 وH2B (الشكل 5، الجدول S3) والآخر يتفاعل مع MDN1 وLRCH4 وH2B (الشكل 6).
يستحث IFNα شبكة تفاعل HLA-A مع H2B (H2BFS) وHMGA1.(أ) مؤامرة ثنائية الأبعاد (تم إنشاؤها في برنامج SIM-XL) تصور أنواعًا مختلفة من التفاعلات في مجمع H2B-HLA-A-HMGA1: الارتباط البيني (الأزرق)، الارتباط البيني (الأحمر) والرابط الفردي (أسود)..يتم ترميز المجالات ذات الهويات المختلفة بالألوان: H2B (هيستون؛ 2–102) وMHC-I (MHC_1؛ 25–203، المجموعة C1؛ 210–290 وMHC_I_C؛ 337–364).تم تعيين عتبة الارتباط المتبادل عند 3.5.تشير المؤامرات النقطية إلى مواقع تفاعل HLA-A مع H2B (B) وHMGA1 (C)، بالإضافة إلى مواقع التفاعل K أو S بين الببتيدين.في الشكل، تم تعيين عتبة نقاط الارتباط المتبادل على 3.0.(د) العلاقات بين البروتينات الموضحة في هياكل البروتينات H2B وHLA-A وHMGA1 في برنامج PyMOL.تم تصميم هذه الهياكل باستخدام خادم Phyre2 (//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) وكانت هياكل القالب لبروتينات H2B وHLA-A وHMGA1 هي 1kx552 و1kj349 و2eze55 على التوالي.
يستحث IFNα شبكة تفاعل HLA-A مع H2B (H2BFS) وMDN1 وLRCH4.(أ) الروابط الجزيئية (الحمراء) والجزيئات (الزرقاء) المعروضة على خريطة تفاعلية ثنائية الأبعاد (تم إنشاؤها في برنامج SIM-XL) مع تمثيل MDN1 كدائرة.تم تعيين عتبة الارتباط المتبادل عند 3.5.يتم ترميز المجالات ذات الهويات المختلفة بالألوان: H2B (هيستون؛ 2–102)، MHC-I (MHC_1؛ 25–203، المجموعة C1؛ 210–290 وMHC_I_C؛ 337–364) وLRCH4 (LRR_8 (68–126)، LRR_8 (137–194) وCH (535–641)).(ب) العلاقات بين البروتينات الموضحة في هياكل البروتينات H2B وHLA-A وLRCH4 وMDN1 في برنامج PyMOL.تم تصميم هذه الهياكل باستخدام خادم Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) مع هياكل القالب 1kx552 و1kj349 و6hlu62 و6i2665 لبروتينات H2B وHLA-A وLRCH4 وMDN1، على التوالى.مخططات نقطية توضح مواقع تفاعل K أو S لـ HLA-A مع H2B (C)، وLRCH4 (D)، وMDN1 (E).بالنسبة للمؤامرات، تم تعيين عتبة نقاط الارتباط المتبادل إلى 3.0.
بالإضافة إلى الحفاظ على سلامة الجينوم، يشارك هيستون H2B أيضًا في تنظيم النسخ.يتكون بروتين H2B من مجال هيستون مركزي (HFD) يتكون من ثلاث حلزونات α مفصولة بحلقات وذيل طرفي C 41،52.يحدث معظم التفاعل مع H2B في الحلزون α1، والذي يوفر التشذيب باستخدام مغاير مغاير HFD (الشكل 5A، B).على الرغم من أن اللايسينات متورطة في ربط الحمض النووي، إلا أن بعض اللايسينات هي أيضًا مواقع أستلة أو مثيلة بديلة.على سبيل المثال، لا تشارك البقايا K43 وK46 وK57 من H2B في ربط الحمض النووي المباشر، ولكنها أهداف لمختلف تعديلات ما بعد النسخ.وبالمثل، قد تلعب البقايا K44 وK47 وK57 في H2B دورًا بديلاً في وجود IFNα، بما في ذلك التفاعلات مع البروتينات الأخرى (الشكل 5A، B).بالإضافة إلى ذلك، يقوم هيستون H2B خارج الصبغي بتنشيط الاستجابة المناعية في أنواع مختلفة من الخلايا، حيث يعمل بمثابة مستشعر عصاري خلوي للكشف عن شظايا الحمض النووي المزدوج (dsDNA) المستمدة من العوامل المعدية أو الخلايا التالفة.في وجود فيروسات الحمض النووي، أدى استنفاد H2B إلى تثبيط إنتاج IFN-β والتفسفر STAT154.ومن المعروف أيضًا أن H2B يتحرك داخل وخارج النواة بشكل أسرع من الهستونات الأساسية الأخرى .ولوحظت أيضًا تفاعلات H2B مع MDN1 وLRCH4 في عينات مختارة غير معالجة.لقد وجدنا أن HLA-A تفاعل مع H2B في جميع العينات الثلاثة المعالجة بـ IFNα وفي عينة متكررة واحدة غير معالجة.تعكس هذه البيانات دور H2B في وظيفة فسيولوجية بديلة مستقلة عن تنظيم النسخ.
تم التعرف على HMGA1 (مجموعة عالية الحركة AT-Hook 1)، وهو بروتين نووي صغير غني بالأحماض الأمينية المعززة للأمراض، بالتعاون مع HLA-A.يحتوي على ذيل طرفي حمضي C وثلاثة DBDs مميزة تسمى خطافات AT لأنها ترتبط بالأخدود الصغير للمنطقة الغنية بـ AT في dsDNA55،56.يؤدي هذا الارتباط إلى انحناء الحمض النووي أو استقامته، مما يسمح لعوامل النسخ الأساسية بالوصول إلى التسلسل المتفق عليه.يُعتقد أن ذيل الطرف C متورط في تفاعلات البروتين البروتين وتوظيف عوامل النسخ، نظرًا لأن طفرات حذف الطرف C غير قادرة على بدء النسخ 57 .علاوة على ذلك، يحتوي هذا المجال على العديد من مواقع الفسفرة المحفوظة والتي تُعرف بأنها ركائز للكينازات 58.لاحظنا تفاعلات HLA-A وH2B مع HMGA1 خارج مجال الطرف C، مما يشير إلى أن مجال الطرف C يستخدم بشكل أساسي لربط عامل النسخ (الشكل 5A، C).تتنافس بروتينات HMGA مع هيستون H1 في الارتباط بالحمض النووي المحول، وبالتالي زيادة إمكانية الوصول.وبالمثل، يبدو من المحتمل أن يتفاعل HMGA مع هيستون H2B على طول الحمض النووي الرابط في منافسة مع هيستون H1.يستحث HMGB1 التعبير عن HLA-A و-B و-C في الخلايا الجذعية، مما يؤدي إلى تنشيطها، ولكن لم يتم الإبلاغ عن تفاعل بين HMG وHLA مسبقًا.لقد وجدنا أن HMGA1 يتفاعل مع مجالات α1 وα3 لـ HLA-A، مع معظم التفاعلات خارج 3 DBD (الشكل 5A،C).في أيدينا، تم العثور على HLA-A ليكون موضعيًا في النواة (البيانات غير معروضة)، وبالنظر إلى وجود H2B وHMGA1 أيضًا في النواة، فمن المحتمل أن يحدث هذا التفاعل في النواة.يتم عرض adducts محددة تقاس بين H2B، HLA-A، وHMGA1 في الشكل 5D.
تحدث معظم تفاعلات HLA-A مع البروتينات الأخرى ضمن نطاقاتها α1 وα2 والمجال الطرفي C المضطرب (الشكل 6).في أحد هذه الأمثلة، وجدنا أن HLA-A يتفاعل مع ذيل N-terminal المضطرب لـ LRCH4 (الشكل 6A، D).ينظم LRCH4 تنشيط TLR4 وتحريض السيتوكينات LPS، وبالتالي تعديل الاستجابة المناعية الفطرية.وهو عبارة عن بروتين غشائي يحتوي على تسعة تكرارات غنية بالليوسين (LRRs) ونموذج متماثل للهيمودولين (CH) في مجاله الخارجي، يليه مجال عبر الغشاء (TMD) 60، 62.تم الإبلاغ عن مجالات CH للتوسط في تفاعلات البروتين البروتين 60.يمكن الوصول نسبيًا إلى امتداد حوالي 300 من الأحماض الأمينية بين نطاقي LRR وCH، ولكنه غير منظم.استنادًا إلى وظيفة المناطق المضطربة كوسطاء لشبكات البروتين البروتين والنقل الحويصلي 63، وجدنا أن معظم تفاعلات البروتين تحدث في المناطق المضطربة.تم توزيع التفاعلات مع MDN1 على طول طول البروتين، بما في ذلك مجالات LRR1 وLRR6 وCH والمناطق العشوائية، بينما يرتبط H2B بشكل أساسي بمجال CH (الشكل 6A، B).والجدير بالذكر أن أيا من التفاعلات لم تشمل المفصل الفكي الصدغي، مما يشير إلى خصوصية نهج CLMS (الشكل 6A، B).
تم تحديد MDN1 أيضًا كجزء من شبكة البروتين HLA-A (الشكل 6A).إنه ينتمي إلى عائلة البروتينات AAA (ATPases المرتبطة بأنشطة مختلفة).هذا هو نفس مجال AAA N-terminal الذي ينظم في حلقة سداسية ويزيل عامل التجميع من الوحدة الفرعية الريبوسومية 60S 64.يبدو أنه مشابه لـ dynein64،65،66.بالإضافة إلى ذلك، يتبع المنطقة الغنية بـ Asp/Glu مجال MIDAS (موقع يعتمد على الأيونات المعدنية).نظرًا للحجم الكبير لـ MDN1 (حوالي 5600 من الأحماض الأمينية) وتماثله المحدود مع البروتينات المدروسة جيدًا، لا يُعرف سوى القليل عن بنيته ووظيفته في البشر.حددنا HLA-A وH2B وLRCH4 كشركاء ربط MDN1 وكشفنا عن توجههم كمجمعات بروتينية في PyMol (الشكل 6A، B).تتفاعل هذه البروتينات الثلاثة مع مجال AAA، ومجال الرابط الشبيه بالداينين، وربما مجال MIDAS MDN1.في تقرير سابق، حددت تنقية تقارب بروتينات الطعم MDN1 كبروتين مرتبط بهيستون H2B67.بالإضافة إلى ذلك، أفادت دراسة حديثة أيضًا عن تفاعل بين MDN وHLA-B في خلايا HCT116 باستخدام قياس الطيف الكتلي المنقى بالتقارب، مما يدعم النتائج التي توصلنا إليها.يشير تحديد هذا المركب في العينات المعالجة بـ IFNα إلى دور MDN1 في إشارات الإنترفيرون.
نظرًا لأن جينات HLA متعددة الأشكال بدرجة كبيرة، فقد استخرجنا قراءات التسلسل لرسم خرائط HLA-A و-B و-C من بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA) لخلايا Flo-1 (البيانات غير معروضة).كشفت تسلسلات الببتيد المتوافقة مع قراءة التسلسل عن اختلافات كبيرة بين HLA-A و-B و-C في المناطق التي توجد فيها الببتيدات المتقاطعة في HLA-A (الشكل S3).بالإضافة إلى ذلك، لم نلاحظ الارتباط المتبادل بين البروتين والبروتين لجزيئات HLA-B/C مع بروتينات H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4.يشير هذا إلى أن تفاعل البروتين الموجود بين HLA-A وMDN1 وLRCH1 وHMGA1 هو تفاعل خاص بـ HLA-A.بالإضافة إلى ذلك، أظهر التحليل البروتيني للعينات غير المتشابكة (الجدول S4) أن HLA-A يتمتع بتغطية تسلسلية أعلى مقارنةً بـ HLA-B أو HLA-C.كانت الببتيدات المحددة لـ HLA-A عالية الكثافة في كل من العينات المعالجة وغير المعالجة بـ IFNα.
للتأكد من أن التفاعلات المحددة هنا لم تكن بسبب الارتباط المتبادل غير المحدد لاثنين من البروتينات على مقربة مكانية قريبة، أكدنا أيضًا وجود عاملين تفاعليين جديدين لـ HLA-A من خلال إجراء فحوصات الهطول المناعي المشترك.تم الكشف عن تفاعلات HLA-A مع MDN1 وH2B الذاتية في كل من خلايا Flo-1 المعالجة وغير المعالجة بـ IFNα (الشكل 7، الشكل S4).أكدنا أن HLA-A تم التقاطه بواسطة H2B في المترسب المناعي وأن هذا الارتباط كان بسبب علاج IFNα حيث كان HLA-A غائبًا في عينات المترسب المناعي من الخلايا غير المعالجة (الشكل 7A).ومع ذلك، تشير بياناتنا إلى أن IFNα ينظم ارتباط HLA-A بشكل تفاضلي بـ H2B وMDN1.يحفز IFNα الارتباط بين H2B وHLA-A، لكنه يقلل من ارتباطه بـ MDN1.لقد وجدنا أن MDN1 كان مرتبطًا بـ HLA-A في عناصر التحكم، كما أدت إضافة IFNα إلى تقليل هذا التفاعل بشكل مستقل عن تحريض MDN1 بواسطة IFNα (الشكل 7B، C).بالإضافة إلى ذلك، التقط الهطول المناعي HLA-A H2B في خلايا A549 (الشكل S4)، مما يشير إلى أن هذا التفاعل مستقل عن نوع الخلية.تدعم هذه النتائج مجتمعة تفاعلات HLA-A بوساطة الإنترفيرون مع H2B وMDN1.
يقوم HLA-A بتنقية H2B وMDN1.تم تحصين الكتل المناعية الذاتية التمثيلية H2B (A) وMDN1 (B) من خلايا Flo-1 المعالجة بـ IFNα وتم فحصها بحثًا عن الأجسام المضادة المشار إليها.تم استخدام الفأر والأرانب IgG كعنصر تحكم سلبي.(ج) يتم تصوير الكميات النسبية (المدخلات) من المستضدات المختلفة بواسطة الكتل المناعية التي تم فحصها ضد الأجسام المضادة المشار إليها، وتم استخدام β-actin كعنصر تحكم في التحميل.
تمت دراسة الخصائص الهيكلية لإحدى الشبكات المترابطة الموثوقة للغاية والمحدثة بالإنترفيرون، وهي H2B-HLA-A-HMGA1.استخدمنا نمذجة الديناميكيات الجزيئية كنهج بديل لفهم الديناميكيات التوافقية للبروتينات المشاركة في هذا المجمع (الشكل 8).تشير الاستنتاجات من بيانات CLMS إلى إمكانية وجود تطابقات مختلفة للبروتينات H2B وHLA-A وHMGA1.لذلك، تم تصميم المجمعات المحتملة التالية في وسط مذيب: H2B-HLA-A، HMGA1-HLA-A، وH2B-HLA-A-HMGA1.اقترحت شاشة إرساء بروتين بروتين أولية باستخدام حزمة MOE (بيئة التشغيل الجزيئية؛ مجموعة الحوسبة الكيميائية، مونتريال، كيبيك، كندا) توافقات محتملة تختلف بين هذه البروتينات (الشكل 8 أ).كشف تصور مجمع بروتين الالتحام عن العديد من التفاعلات والتوافقات المحتملة (الشكل 5A، 8).وبالتالي، يظهر شكل واحد محتمل في الشكل 8A (مع الروابط المتقاطعة المسماة) وتم تقييمه أيضًا باستخدام خط أنابيب النمذجة MD.بالإضافة إلى ذلك، فإن ربط H2B أو HMGA1 بـ HLA-A يسلط الضوء على التقارب العالي لـ H2B لـ HLA-A (الشكل 8A).
الديناميكيات المطابقة للشبكات المحتملة بين مجمعات H2B (H2BFS) -HLA-A وHMGA1-HLA-A وH2B-HLA-A-HMGA1.(أ) اللوحة اليسرى عبارة عن خريطة ثنائية الأبعاد (تم إنشاؤها في برنامج SIM-XL) للروابط الجزيئية (الحمراء) وبين الجزيئات (الزرقاء) (تم ضبط قطع الارتباط التشعبي على 3.5).بالإضافة إلى ذلك، يتم تصنيف بقايا الارتباط المتقاطع التي تم تحديدها على هياكل البروتينات H2B وHLA-A وHMGA1.تم استخراج المطابقات المرتبطة بهذه البروتينات باستخدام خط أنابيب الالتحام المطبق في حزمة MOE.تُظهر اللوحة السفلية اليسرى مختلف المطابقات المحتملة لمجمعات H2B-HLA-A وHMGA1-HLA-A مع ارتباطات مختلفة لربط البروتين بالبروتين (GBVI/WSA dG؛ كيلو كالوري/مول).(ب) الانحراف المعياري (RMSD) للمواقع الذرية (باستثناء ذرات الهيدروجين) لكل بنية بروتينية.(C) تفاعلات رابطة الهيدروجين بين البروتين والبروتين بين الجزيئات من مجمعات محاكاة مختلفة مع الأخذ في الاعتبار تفاعلات محددة مدتها ≥ 10 نانوثانية.تم ضبط مسافة قطع المانح والمستقبل للسندات h على 3.5 Å، وتم ضبط زاوية قطع المانحين والمتقبل H على ≥ 160 درجة -180 درجة.(د) المخلفات الموسومة التي تشكل تفاعلات البروتين والبروتين HLA-A مع شركائها، والتي تمتد ≥ 20 نانوثانية، المستخرجة من مجمعات HLA-A-H2B وHLA-A-HMGA1 الوهمية.تمثل هياكل البروتين بنية متوسطة تبلغ 100 ns MDS.(E) التفاعلات بين مجمعات HLA-A-H2B وHLA-A-HMGA1 مقارنة بالتفاعلات التي تتبعها محاكاة H2B-HLA لأكثر من 100 نانوثانية بناءً على موقع التفاعل K أو S بين الببتيدين.المجمعات /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.تم تعيين قيمة العتبة لتقييم الروابط المتقاطعة على 3.0، وتم أخذ التفاعلات المحددة من MDS التي تأخذ ≥ 10 ns في الاعتبار.تم تصور هياكل البروتين باستخدام حزم BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes، BIOVIA Corp.، San Diego، CA، USA) وبيئة التشغيل الجزيئية (MOE؛ Chemical Computing Group Inc.، Montreal، Quebec، Canada).
أشار استقرار جزيئات HLA-A مع مرور الوقت (الانحراف المعياري؛ RMSD أو الانحراف المعياري؛ RMSF) إلى أن وجود بروتينات H2B أو HMGA1 في المجمعات استقر HLA-A (الشكل 8B، الشكل S5).يرتبط بروتين HMGA1 بإحكام بموقع B2M الخاص بـ HLA-A، مما يؤدي إلى استقرار الأحماض الأمينية HLA-A في مجمع HLA-A-HMGA1 أو H2B-HLA-A-HMGA1 (الشكل 8ب، الشكل S5).على وجه الخصوص، تم العثور على بقايا HLA ~60-90 و~180-210 لتكون أقل مرونة في وجود H2B (الشكل 8B).أظهر H2B وHMGA1 ارتباطًا أفضل بـ HLA-A في مجمع H2B-HLA-A-HMGA1 مقارنة بربط HLA-A بـ H2B أو HMGA1 وحده (الشكل 8C، D؛ الجدول S5).تتزامن المخلفات المشاركة في الترابط الهيدروجيني (الشغل العالي على طراز MD ≥ 10 ns) مع مواقع تفاعل CLMS (بقايا K أو S) في المجمع، مما يشير إلى أن التفاعلات التي تم تحديدها بواسطة CLMS موثوقة للغاية.الموثوقية (الشكل 8E ).في نمذجة CLMS وMD، تم العثور على بقايا HLA-A بين حوالي 190-210 وحوالي 200-220 من الأحماض الأمينية ترتبط بـ H2B وHMGA1، على التوالي (الشكل 8E).
تشكل تفاعلات البروتين البروتين شبكات هيكلية ديناميكية تتوسط الاتصال داخل الخلايا استجابة لمحفزات معينة.نظرًا لأن العديد من أساليب علم البروتينات تكتشف التغيرات في مستوى الحالة المستقرة الشاملة للبروتين، فإن ديناميكيات التفاعل بين البروتين والبروتين تتطلب أدوات إضافية لالتقاط واجهات الربط، ويعد CLMS أحد هذه الأدوات.نظام إشارات الإنترفيرون عبارة عن شبكة سيتوكينات تسمح للخلايا بالاستجابة لمجموعة من الإشارات المرضية البيئية والمرضية الجوهرية، والتي تبلغ ذروتها في تحريض مجموعات فرعية من البروتينات المحفزة للإنترفيرون.قمنا بتطبيق CLMS لتحديد ما إذا كان من الممكن تحديد تفاعلات البروتين البروتين الجديدة بين لوحة من البروتينات التي يسببها الإنترفيرون.تم استخدام تحليل الارتباط المتبادل للبروتين العالمي في نموذج خلية Flo-1 المستجيب للفيروسات لالتقاط مجمعات البروتين.استخراج الببتيدات التربتية من الخلايا غير المترابطة والمترابطة يسمح بحساب الببتيد، وإثراء المسار، وتوزيع طول الببتيد بكثافة LFQ محددة.تم تحديد البروتينات المحفزة للإنترفيرون الكنسي كعنصر تحكم داخلي إيجابي، في حين تمت ملاحظة منتجات جديدة مترابطة بين الجزيئات وداخل الجزيئات من البروتينات المحفزة للإنترفيرون مثل MX1 وUP18 وOAS3 وSTAT1.وقد تم التحقيق في السمات الهيكلية المختلفة والتفاعلات في المجالات الوظيفية.
تم اكتشاف تفاعل بين HLA-A وMDN1 وH2B عن طريق التطعيم المناعي في خلايا Flo-1 وA549 المعالجة وغير المعالجة بـ IFNα.تسلط نتائجنا الضوء على مجمعات HLA-A التي تحتوي على H2B بطريقة تعتمد على IFNα.يمثل عملنا وسيلة مثيرة للاهتمام لمزيد من الاستكشاف للتوطين المشترك لهذين المجمعين.سيكون من المثير للاهتمام أيضًا توسيع نهج CLMS ليشمل مجموعة من خطوط الخلايا لتحديد تفاعلات البروتين المستقل عن طريق الإنترفيرون.أخيرًا، استخدمنا نمذجة MD كنهج بديل لفهم الديناميكيات التوافقية للبروتينات المشاركة في مجمع H2BFS-HLA-A-HMGA1، الذي تتبع المحادثات المتبادلة داخل الجزيئات وبين الجزيئات.تشير الاستنتاجات من بيانات CLMS إلى إمكانية وجود توافقات مختلفة لبروتينات H2BFS وHLA-A وHMGA1.كشفت المطابقات المختلفة المحتملة بين مجمعات بروتين الإرساء عن العديد من التفاعلات المشابهة لتلك التي لوحظت في مجموعة بيانات CLMS.واحدة من نقاط القوة الرئيسية لطريقتنا هي أنها تسمح بسهولة التعرف على الجينات المتفاعلة متعددة الأشكال مثل HLA، لذلك سيكون من المثير للاهتمام دراسة تفاعلات البروتينات الخاصة بالنمط الفرداني HLA والتي يصعب دراستها.مجتمعة، توضح بياناتنا أنه يمكن استخدام CLMS لتوسيع فهمنا لشبكات الإشارات الناجمة عن الإنترفيرون وتوفير أساس لدراسة الأنظمة بين الخلايا الأكثر تعقيدًا في البيئة الدقيقة للورم.
تم الحصول على خلايا Flo-1 من ATCC وتم الحفاظ عليها في DMEM (Gibco) مع إضافة 1٪ بنسلين / ستربتومايسين (Invitrogen)، و10٪ مصل بقري جنيني (Gibco) وتخزينها عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون.حضانة.نمت الخلايا إلى درجة التقاء 70-80% قبل معالجتها بـ IFNα14 (يتم تصنيعها بواسطة مرفق إنتاج البروتين في إدنبرة).تم شراء جميع المواد الكيميائية والكواشف الأخرى من Sigma Aldrich ما لم يُذكر خلاف ذلك.
تم استزراع خلايا Flo-1 في 6 أطباق جيدة وفي اليوم التالي عولجت الخلايا بـ 10 نانوغرام/مل من IFNα14 لمدة 24 ساعة حتى التقاء 80% تقريبًا.تم غسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS وربطها باستخدام DSS (Thermo Fisher Scientific) الطازج (المذاب في DMSO) في PBS لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية إلى تركيز نهائي قدره 0.5 مم.تم استبدال تفاعل التشابك DSS بـ PBS وتم إخماد DSS المتبقي بإضافة 20 مللي مولار تريس (الرقم الهيدروجيني 8.0) في PBS لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.تم جمع الخلايا عن طريق الكشط وجمعها في أنابيب ربط منخفضة (أكسجين).
تم التخلص من بيليه الخلية بـ 300 ميكرولتر من محلول تحلل اليوريا (8 م من اليوريا، 0.1 م تريس، الرقم الهيدروجيني 8.5) لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز عرضي.تم تنفيذ جميع خطوات الطرد المركزي عند 14000 x ج عند 8 درجات مئوية.الطرد المركزي المحللة لمدة 10 دقائق ونقل المادة طافية إلى أنبوب جديد.تم إذابة الجزيئات الصافية المتبقية في 150 ميكرولتر من محلول التحلل الثاني (2 م من اليوريا، 2٪ (وزن / حجم) SDS (كبريتات دوديسيل الصوديوم)) لمدة 30 دقيقة أو أكثر حتى يتم الحصول على محلول مائي متجانس.تم طرد المحللة بالطرد المركزي لمدة 20 دقيقة وتم خلط المادة الطافية مع المحللة التي تم الحصول عليها في الخطوة السابقة.تم تقييم تركيزات البروتين باستخدام اختبار Micro BCA (Thermo Fisher Scientific) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة لإجراءات الصفيحة الدقيقة.تم تجميد العينات بسرعة في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية.
تمت معالجة ما يقرب من 100 ميكروغرام من البروتين المرتبط القابل للذوبان باستخدام بروتوكول إعداد عينة الترشيح المعدل (FASP) كما هو موضح بواسطة Wisniewski et al.69 باختصار، البروتين متشابك مع 200 ميكرولتر من محلول اليوريا (8 مولار من اليوريا في 0.1 مولار تريس، درجة الحموضة 8.5)، ويتم تدويره وتقسيمه إلى النصف.تم تنفيذ جميع خطوات الطرد المركزي عند 14000 x ج عند 25 درجة مئوية.تم نقل النصف الأول من محللة البروتين المتقاطعة إلى جهاز مرشح الطرد المركزي Microcon بقدرة 10 كيلو دالتون والمجهز بغشاء Ultracel-10 (Merck)، يليه الطرد المركزي على المرشح لمدة 25 دقيقة.ثم أضف النصف الثاني من البروتين إلى الفلتر وكرر نفس الخطوات.تم إجراء استعادة البروتين عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من 17 ملي تريس (2-كربوكسي إيثيل) هيدروكلوريد الفوسفين (TCEP) في محلول اليوريا.تم تقليب الاسترداد على خلاط حراري عند 600 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.بالإضافة إلى ذلك، تم الطرد المركزي للعمود وتمت ألكلة البروتين المرتبط المخفض باستخدام 100 ميكرولتر من 50 ملي مولار من اليود أسيتاميد في محلول اليوريا.تم إجراء تفاعل الألكلة عند درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة في الظلام.تدوير العمود، وغسل جدران العمود 3 مرات مع 100 ميكرولتر من اليوريا العازلة، ثم الطرد المركزي.تم إجراء نفس العملية 3 مرات باستخدام 100 ميكرولتر من 100 ملي مولار من بيكربونات الأمونيوم.قبل التريبسين، استبدل أنبوب التجميع بآخر جديد.إضافة عازلة الهضم تحتوي على 50 ملي بيكربونات الأمونيوم و1 ميكرولتر التربسين المخفف في العازلة التربسين (بروميجا).تم الحفاظ على نسبة التربسين إلى البروتين عند حوالي 1:33، وتم تحضين تفاعلات الهضم طوال الليل عند 37 درجة مئوية في غرفة رطبة.تمت إزالة الببتيد المتشابك من المرشح بواسطة الطرد المركزي لمدة 25 دقيقة.تم تحسين استعادة الببتيد بإضافة 50 ميكرولتر من 0.5 مولار كلوريد الصوديوم إلى المرشح، يليه الطرد المركزي لمدة 25 دقيقة.
تم استخدام أعمدة C18 Micro Spin (جهاز هارفارد) لتحلية الببتيدات التربتية المترابطة بعد البروتوكول الموصوف بواسطة Bouchal et al.70 مع تعديلات طفيفة.باختصار، تم تنشيط أعمدة الدوران C18 بثلاث عمليات غسل بحمض الفورميك 0.1% (FA) في الأسيتونيتريل (AcN) (ميرك) وغسلتين بنسبة 0.1% FA.تم ترطيب العمود بنسبة 0.1% من FA لمدة 15 دقيقة.تحميل العينات إلى أعمدة تدور ويغسل 3 مرات مع 0.1% اتحاد كرة القدم.تمت إزالة الببتيدات المحلاة بشكل تسلسلي باستخدام تدرج تدريجي باستخدام 50% و80% و100% AcN في 0.1% FA.تم تجفيف العينات في مكثف SpeedVac Plus (إيبندورف) حتى يختفي السائل المتبقي تمامًا.تم إذابة الببتيدات المخففة في 100 ميكرولتر من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك بنسبة 0.08٪ في AcN بنسبة 2.5٪ وتم قياس التركيزات على NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).تم حقن ما يقرب من 1 ميكروغرام من الببتيد المتشابك لكل عينة في نظام LC-MS/MS.
تم فصل الببتيدات المتقاطعة على نظام UltiMate 3000 RSLCnano LC (Thermo Scientific) المتصل بمطياف الكتلة Orbitrap Exploris 480 (Thermo Scientific).تم جمع الببتيدات المتقاطعة على معرف 300 ميكرومتر وعمود التقاط C18 بطول 5 مم قبل العمود ومعبأ بمادة ماصة C18 PepMap100 وماصة PepMap 5 ميكرومتر (Thermo Scientific).تحميل تدفق المضخة المحددة في 5 ميكرولتر / دقيقة 0.08٪ حمض trifluoroacetic المذاب في 2.5٪ AcN.تم فصل الببتيدات المتقاطعة على عمود سيليكا تحليلي منصهر بقطر داخلي يبلغ 75 ميكرومتر وطول 150 مم، مملوء بمادة ماصة PepMap بحجم 2 ميكرومتر (Thermo Scientific).تتكون المرحلتان المتنقلتان A وB من 0.1% FA في الماء و0.1% FA في الأسيتونتريل، على التوالي.يبدأ التدرج عند 2.5% B ويزداد خطيًا إلى 40% B خلال 90 دقيقة، ثم إلى 90% B خلال الدقيقتين التاليتين.تم الحفاظ على تكوين الطور المتحرك عند 90% B لمدة 10 دقائق ثم انخفض خطيًا إلى 2.5% B خلال دقيقتين.تمت معايرة العمود عند 2.5% B لمدة 8 دقائق قبل الدورة التالية.تم تأين الببتيدات المتقاطعة المستخرجة من العمود التحليلي في مصدر التأين بالرذاذ الكهربائي النانوي (NSI) وحقنها في مطياف الكتلة Exploris 480 (Thermo Scientific).
يعمل مطياف الكتلة Orbitrap Exploris 480 في وضع ارتباط البيانات الإيجابي.تم إجراء فحص كامل في وضع القسم بدقة 120.000 مع إعدادات النطاق من m/z 350 Th إلى m/z 2000 Th.تم ضبط هدف AGC الطبيعي على 300% مع حد أقصى لوقت الإدخال يبلغ 50 مللي ثانية.تم إنشاء اكتشاف الذروة أحادية النظائر للببتيدات.يتم تعيين معلمة استرخاء القيد على القيمة true إذا تم العثور على عدد قليل جدًا من السلائف.تم ضبط الحد الأدنى من القوة الأيونية للسلائف على 5.0e3 وتم تضمين حالات شحن السلائف التي تصل إلى +8 في التجارب.
تم ضبط وقت الدورة بين عمليات الفحص الرئيسية في وضع ارتباط البيانات على 2.5 ثانية.تم ضبط الاستبعاد الشامل الديناميكي على 20 ثانية بعد التجزئة الأولى لأيون السلائف.تم ضبط نافذة عزل السلائف على 2 ث.تم اختيار نوع طاقة الاصطدام الطبيعية مع وضع طاقة الاصطدام الثابت في فحص MS/MS المعتمد على البيانات.تم ضبط طاقة الاصطدام على 30%.تم ضبط دقة Orbitrap على 15000 وهدف AGC على 100%.تم ضبط الحد الأقصى المخصص لوقت الحقن على 60 مللي ثانية.
قبل تتبع شبكة البروتين البروتين في العينات المترابطة، قمنا بمعالجة الملفات الخام باستخدام حزمة MaxQuant (الإصدار 1.6.12.0) لتحديد الببتيدات/البروتينات التي يمكن تتبعها في العينات.بالإضافة إلى ذلك، تم إجراء تحليلات بروتينية مماثلة على عينات Flo-1 غير المترابطة التي تمت معالجتها وغير المعالجة باستخدام IFNα.تم البحث عن بيانات MS/MS في قاعدة بيانات UniProt البشرية (www.uniprot.org) (تم تحميلها في 12 أغسطس 2020، وتحتوي على 75,093 إدخالًا) باستخدام محرك البحث المدمج Andromeda27.تم إجراء البحث دون الإشارة إلى خصوصية الإنزيم والتعديلات المختلفة لإزالة الرطوبة (N، Q) والأكسدة (M).تم ضبط التسامح الشامل للسلائف عند 20 جزء في المليون وأيونات المنتج عند 0.02 دا.تم ضبط الانحراف الشامل الأولي والحد الأقصى على 10 جزء في المليون.تم تحديد الحد الأقصى لكتلة الببتيد عند 4600 دا وتم تحديد تشابه التسلسل بين 7 و 25 من الأحماض الأمينية (aa).تم إجراء مزيد من التحليل الإحصائي باستخدام برنامج Perseus (الإصدار 1.6.10.45).تم حساب محتوى البروتين عن طريق تطبيع الكثافة الطيفية للبروتين (كثافة LFQ؛ القياس الكمي غير المسمى) وتم تحويل قيم الكثافة إلى Log2.تم بناء مجموعة هرمية من البروتينات التي تم تحديدها من خلال كثافة الببتيد باستخدام حزمة pheatmap (v1.0.12) في R (v 4.1.2).تم إجراء تحليل تخصيب المسار باستخدام قاعدة بيانات مسار Reactome للبروتينات المعالجة بـ IFNα والتي تم تنشيطها أكثر من أربع مرات مقارنة بالعينات غير المعالجة.
تم إجراء تحديد الروابط الكيميائية المحددة لليسين (K) أو السيرين (S) لمجمعات البروتين التي تتم مراقبتها بواسطة LC-MS/MS باستخدام آلة تحديد طيفية (SIM-XL) للببتيدات المتشابكة (SIM-XL).أولاً، تمت دراسة التفاعلات المحتملة بين جينات توقيع مقاومة تلف الحمض النووي (IRDS) المرتبطة بالإنترفيرون (IFN) باستخدام مجموعة بيانات بروتين IRDS الموصوفة في Padariya et al.28.يعد فحص جميع الظروف والتكرارات الخاصة بـ UniProt البشري بأكمله أمرًا مكثفًا من الناحية الحسابية، وبالتالي فإن قاعدة بيانات UniProt البشرية بأكملها (www.uniprot.org) (تم تنزيلها في 12 أغسطس 2020، تحتوي على 75,093 إدخالًا) مقابل التكرارات المعالجة بـ IFNα.أحد المرشحات للتفاعلات ذات الثقة العالية.تم توسيع هذه التفاعلات ذات الأهمية العالية التي تم الحصول عليها واختبارها في جميع التكرارات والظروف.
في SIM-XL، تم استخدام DSS للرابط المتشابك (XL) وتم ضبط إزاحة الوزن XL وتعديل الوزن على 138.06 و156.07 على التوالي.يتم أخذ مواقع التفاعل المتشابك التالية بعين الاعتبار: KK، وKS، وKN-TERM، بدون أيونات مراسلة.تم ضبط كل من السلائف والجزء جزء في المليون على 20 وتم ضبط عتبة Xrea على 0.15.تم اعتبار التربسين محددًا تمامًا، وتم تنفيذ طريقة تجزئة C-trap (HCD) عالية الطاقة.تم تعيين عتبة تخفيض قاعدة البيانات الديناميكية XCorr والحد الأدنى لعدد الببتيدات لتقليل قاعدة البيانات الديناميكية على 2.5 و2 على التوالي.المعلمات الأخرى هي: احتمالية النظائر الأحادية وذروة القطع المتزامن، الحد الأدنى 4 بقايا AA لكل حبلا والحد الأقصى لشحنة الجديلة، و3 حد أقصى للانقسامات المفقودة.تم تحليل الخرائط ثنائية الأبعاد الناتجة في (SIM-XL) وتم استخدام التمثيل الرسومي xQuest28 لبناء الخرائط ثنائية الأبعاد.يتم توفير روابط البروتين المتقاطعة على هياكل البروتين في PyMol (نظام الرسومات الجزيئية PyMOL، الإصدار 2.0 Schrödinger، LLC).
تم إنشاء هياكل نماذج البروتين باستخدام خادم Phyre2 (//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) باستخدام مبادئ نمذجة التماثل وتنفيذ "طريقة ماركوف المخفية".يقوم Phyre2 بإنشاء هياكل نموذجية تعتمد على محاذاة التسلسل مع هياكل البروتين المعروفة.بالنسبة لبروتينات H2BFS وHLA-A وHMGA1 وLRCH4 وMDN1، تم استخدام هياكل القالب 1kx552 و1kj349 و2eze55 و6hlu62 و6i2665.بالإضافة إلى ذلك، تم أيضًا النظر في بنية AlphaFold71 MX1 وUBP18 وROBO1.تم تصور بنية البروتين باستخدام حزمة BIOVIA Discovery Studio Visualizer (Dassault Systèmes، BIOVIA، San Diego، CA، USA) وحزمة بيئة التشغيل الجزيئية (MOE؛ Chemical Computing Group Inc.، Montreal، Quebec، Canada).