347 أنابيب ملفوفة من الفولاذ المقاوم للصدأ مقاس 12.7*1.24 مم، آلية جزيئية للتكثيف الكهروستاتيكي المتزامن وتجميع ألفا سينوكلين وتاو

شكرا لكم لزيارة Nature.com.أنت تستخدم إصدار متصفح مع دعم محدود لـ CSS.للحصول على أفضل تجربة، نوصي باستخدام متصفح محدث (أو تعطيل وضع التوافق في Internet Explorer).بالإضافة إلى ذلك، ولضمان الدعم المستمر، نعرض الموقع بدون أنماط وجافا سكريبت.
أشرطة التمرير تعرض ثلاث مقالات لكل شريحة.استخدم زري الرجوع والتالي للتنقل عبر الشرائح، أو أزرار التحكم في الشرائح الموجودة في النهاية للتنقل خلال كل شريحة.

347 مواصفات أنابيب الفولاذ المقاوم للصدأ

347 12.7*1.24 مللي متر أنابيب ملفوفة من الفولاذ المقاوم للصدأ

القطر الخارجي: 6.00 مم OD حتى 914.4 مم OD، مقاسات تصل إلى 24 بوصة NB متوفرة في المخزون، وأنابيب فولاذية بحجم OD متاحة في المخزون السابق

نطاق سمك الأنبوب SS 347: 0.3 مم - 50 مم، SCH 5، SCH10، SCH 40، SCH 80، SCH 80S، SCH 160، SCH XXS، SCH XS
WT: SCH5S، SCH10S، SCH40S، SCH80S، SCH160S، إلخ. (0.5-12 مم) أو الحجم غير العادي ليتم تصميمه حسب الحاجة

النوع: SS 347 مواسير غير ملحومة |أنابيب SS 347 المتفجرات من مخلفات الحرب |مواسير ملحومة SS 347 |SS 347 الأنابيب المصنعة |أنابيب SS 347 CDW، أنابيب LSAW / ملحومة / معاد رسمها

النموذج: أنابيب / أنابيب مستديرة SS 347، أنابيب / أنابيب مربعة SS 347، أنابيب / أنابيب مستطيلة SS 347، أنابيب ملفوفة SS 347، شكل "U" SS 347، ملفات كعكة المقلاة SS 347، أنابيب هيدروليكية SS 347

الطول: مفرد عشوائي، مزدوج عشوائي وطول النهاية المطلوب: نهاية عادية، نهاية مشطوفة، مداس

الحماية النهائية: أغطية بلاستيكية |التشطيب الخارجي: 2B، رقم 4، رقم 1، رقم 8 تشطيب مرآة لأنابيب الفولاذ المقاوم للصدأ، التشطيب حسب متطلبات العميل

حالة التسليم: صلب ومخلل، مصقول، صلب مشرق، مسحوب على البارد

التفتيش، تقارير الاختبار: شهادات اختبار المطحنة، EN 10204 3.1، التقارير الكيميائية، التقارير الميكانيكية، تقارير اختبار PMI، تقارير الفحص المرئي، تقارير فحص الطرف الثالث، تقارير المختبر المعتمدة من NABL، تقرير الاختبار المدمر، تقارير الاختبار غير المدمر

التعبئة: معبأة في صناديق خشبية، أكياس بلاستيكية، شرائط الصلب المجمعة، أو حسب طلبات العملاء

العروض الخاصة: يمكن تصنيع مقاسات ومواصفات أخرى غير المذكورة أعلاه عند الطلب

نطاق حجم الأنبوب SS 347: 1/2 بوصة NB، OD إلى 24 بوصة

ASTM A312 347: أنابيب الأوستنيتي الملحومة وغير الملحومة والمستقيمة المخصصة لدرجات الحرارة المرتفعة وخدمة التآكل العامة.حشو المعدن غير مسموح به أثناء اللحام.

ASTM A358 347: الأنابيب الأوستنيتي الملحومة بالكهرباء للتآكل و/أو الخدمة في درجات الحرارة المرتفعة.عادةً يتم إنتاج الأنابيب التي يصل حجمها إلى 8 بوصة فقط وفقًا لهذه المواصفات.يُسمح بإضافة معدن الحشو أثناء اللحام.

ASTM A790 347: أنابيب الحديد/الأوستنيت (المزدوجة) الملحومة وغير الملحومة والمستقيمة المخصصة لخدمة التآكل العامة، مع التركيز بشكل خاص على مقاومة التشقق الناتج عن التآكل الإجهادي.

ASTM A409 347: أنابيب ذات جدران خفيفة أوستنيتي ملحومة بوصلة مستقيمة أو حلزونية ملحومة بقطر كبير من 14 بوصة إلى 30 بوصة مع جدران Sch5S وSch 10S للتآكل و/أو عالية

ASTM A376 347: أنابيب الأوستنيتي غير الملحومة لتطبيقات درجات الحرارة العالية.

ASTM A813 347: أنابيب أوستنيتي أحادية التماس أو ملحومة مفردة أو مزدوجة لدرجات الحرارة المرتفعة وتطبيقات التآكل العامة.

ASTM A814 347: أنابيب الأوستنيتي الملحومة على البارد لدرجات الحرارة المرتفعة وخدمة التآكل العامة.

التركيب الكيميائي لأنابيب الفولاذ المقاوم للصدأ 347H

الخواص الميكانيكية لأنابيب الفولاذ المقاوم للصدأ 347H

الخصائص الفيزيائية لأنابيب الفولاذ المقاوم للصدأ 347H

درجات مكافئة لأنابيب الفولاذ المقاوم للصدأ 347H

يعد تراكم أميلويد ألفا سينوكلين (αS) سمة مميزة لمرض باركنسون وغيره من اعتلالات Synucleinopathy.في الآونة الأخيرة، ارتبط بروتين تاو المرتبط عادة بمرض الزهايمر مع أمراض αS ووجد أنه يتواجد في الشوائب الغنية بـ αS، على الرغم من أن الآلية الجزيئية لتجميع البروتينين لا تزال غير واضحة.نذكر هنا أن مرحلة αS تنفصل إلى مكثفات سائلة عبر تكثيف معقد إلكتروستاتيكي مع ببتيدات موجبة الشحنة مثل تاو.اعتمادًا على ألفة αS للتعددات ومعدل استنفاد التكافؤ في شبكة التخثر، تخضع الجلطات للجيل السريع أو التحام يليه تراكم الأميلويد البطيء.من خلال الجمع بين مجموعة من التقنيات الفيزيائية الحيوية المتقدمة، تمكنا من توصيف فصل الطور السائل عن السائل αS/Tau وتحديد العوامل الرئيسية التي تؤدي إلى تكوين مجاميع غير متجانسة تحتوي على كلا البروتينين في مكثفات البروتين السائل.
بالإضافة إلى حجرات الغشاء، يمكن أيضًا تحقيق الفصل المكاني في الخلايا من خلال تكوين أجسام كثيفة غنية بالبروتين وشبيهة بالسائل تسمى المكثفات الجزيئية الحيوية أو القطرات، من خلال عملية تعرف باسم فصل الطور السائل عن السائل (LLPS).تتشكل هذه القطرات من خلال تفاعلات زمنية متعددة التكافؤ، عادة بين البروتينات أو البروتينات والحمض النووي الريبوزي (RNA)، وتخدم مجموعة متنوعة من الوظائف في جميع الأنظمة الحية تقريبًا.يُظهر عدد كبير من البروتينات القادرة على LLP تسلسلات منخفضة التعقيد والتي تكون شديدة الاضطراب في الطبيعة وفي تكوين المكثفات الجزيئية الحيوية .كشفت العديد من الدراسات التجريبية عن الطبيعة المرنة والمضطربة ومتعددة التكافؤ للبروتينات التي تشكل هذه المكثفات الشبيهة بالسائل، على الرغم من أنه لا يُعرف سوى القليل عن المحددات الجزيئية المحددة التي تتحكم في نمو ونضج هذه المكثفات إلى كائنات أكثر صلابة. ولاية..
تدعم البيانات الجديدة الفرضية القائلة بأن LLPS الشاذ الذي يحركه البروتين وتحويل القطرات إلى هياكل صلبة قد تكون مسارات خلوية ذات صلة تؤدي إلى تكوين مجاميع سامة غير قابلة للذوبان والتي غالبًا ما تكون من السمات المميزة للأمراض التنكسية.العديد من البروتينات المضطربة جوهريًا (IDPs) المرتبطة بـ LLPS، والتي غالبًا ما تكون مشحونة ومرنة للغاية، ارتبطت منذ فترة طويلة بالتنكس العصبي من خلال عملية تجميع الأميلويد.على وجه الخصوص، ثبت أن مكثفات IDP الجزيئية الحيوية مثل FUS7 أو TDP-438 أو البروتينات ذات المجالات الكبيرة منخفضة التعقيد مثل hnRNPA19 تتحول إلى أشكال تشبه الهلام أو حتى أشكال صلبة من خلال عملية تسمى التميع.مُجَمَّع.إلى المرحلة الانتقالية الصلبة (LSPT) كدالة للوقت أو استجابة لبعض التعديلات بعد متعدية أو طفرات كبيرة من الناحية المرضية.
هناك IDP آخر مرتبط بـ LLPS في الجسم الحي وهو Tau، وهو بروتين مضطرب مرتبط بالأنيبيبات الدقيقة والذي تورط تراكم الأميلويد فيه في مرض الزهايمر 10 ولكنه تورط أيضًا مؤخرًا في مرض باركنسون (PD) وغيره من اعتلالات البروتين النووية المتشابكة 11، 12، 13.لقد ثبت أن تاو ينفصل تلقائيًا عن المحلول/السيتوبلازم بسبب التفاعلات الكهروستاتيكية المواتية 14، مما يؤدي إلى تكوين قطيرات غنية بالتاو تُعرف باسم التضافرات الكهروستاتيكية.وقد لوحظ أيضًا أن هذا النوع من التفاعل غير المحدد هو القوة الدافعة وراء العديد من المكثفات الجزيئية الحيوية في الطبيعة.في حالة بروتين تاو، يمكن تشكيل التجميع الكهروستاتيكي عن طريق التجميع البسيط، حيث تؤدي مناطق البروتين المشحونة بشكل معاكس إلى عملية الانقسام، أو عن طريق التجميع المعقد من خلال التفاعل مع البوليمرات سالبة الشحنة مثل الحمض النووي الريبي (RNA).
في الآونة الأخيرة، تم إثبات α-synuclein (αS)، وهو IDP الأميلويد المتورط في PD وأمراض التنكس العصبي الأخرى المعروفة مجتمعة باسم اعتلال Synucleinopathy17،18، في النماذج الخلوية والحيوانية19،20 المركزة في مكثفات البروتين ذات السلوك الشبيه بالسوائل.أظهرت الدراسات المختبرية أن αS يخضع لـ LLPS عن طريق التجميع البسيط من خلال التفاعلات الكارهة للماء في الغالب، على الرغم من أن هذه العملية تتطلب تركيزات عالية من البروتين بشكل استثنائي وأوقات حضانة طويلة بشكل غير معتاد.ما إذا كانت المكثفات المحتوية على αS والتي تمت ملاحظتها في الجسم الحي تتشكل من خلال هذه العملية أو عمليات LLPS الأخرى تظل مشكلة رئيسية لم يتم حلها.وبالمثل، على الرغم من ملاحظة تراكم الأميلويد αS في الخلايا العصبية في PD وغيره من اعتلالات Synucleinopathy، فإن الآلية الدقيقة التي يخضع بها αS لتراكم الأميلويد داخل الخلايا تظل غير واضحة، حيث لا يبدو أن الإفراط في التعبير عن هذا البروتين يؤدي إلى تحفيز هذه العملية بحد ذاتها.غالبًا ما يكون هناك حاجة إلى تلف خلوي إضافي، مما يشير إلى أن بعض المواقع الخلوية أو البيئات الدقيقة مطلوبة لإعادة نواة تجمعات الأميلويد αS داخل الخلايا.قد تكون إحدى البيئة الخلوية المعرضة بشكل خاص للتجمع هي الجزء الداخلي من مكثفات البروتين 23.
ومن المثير للاهتمام، أنه تم العثور على αS وtau ليتشاركا في التوطين في حالات المرض المميزة لدى البشر المصابين بمرض باركنسون وغيره من اعتلالات Synucleinopathies 24،25 وقد أبلغت التجارب عن وجود علاقة مرضية تآزرية بين البروتينين 26،27 مما يشير إلى وجود علاقة محتملة بين التجميع αS و تاو في الأمراض التنكسية العصبية.مرض.وقد وجد أن αS وtau يتفاعلان ويعززان تجمع بعضهما البعض في المختبر وفي الجسم الحي 28،29، وقد لوحظت تجمعات غير متجانسة مكونة من هذين البروتينين في أدمغة المرضى الذين يعانون من اعتلالات Synucleinopathies 30.ومع ذلك، لا يُعرف سوى القليل عن الأساس الجزيئي للتفاعل بين αS وtau وآلية تجميعه المشترك.تم الإبلاغ عن تفاعل αS مع tau من خلال الجذب الكهروستاتيكي بين منطقة الطرف C المشحونة سالبًا للغاية لـ αS والمنطقة المركزية الغنية بالبرولين في tau، والتي يتم إثراؤها أيضًا بالمخلفات الموجبة الشحنة.
في هذه الدراسة، نظهر أن αS يمكن أن ينفصل بالفعل إلى قطرات عبر التكثيف المعقد الكهروستاتيكي في وجود بروتين تاو، على النقيض من تفاعله مع الببتيدات الأخرى المشحونة إيجابيًا مثل poly-L-lysine (pLK)، وفي هذه العملية .يعمل αS كجزيء سقالة لشبكة القطرات.لقد حددنا اختلافات ملحوظة في عملية نضج αS الكهروستاتيكية، والتي ترتبط بالاختلافات في تكافؤ وقوة تفاعل البروتينات المشاركة في شبكة الكورفات.ومن المثير للاهتمام، أننا لاحظنا التجميع المشترك لبروتينات αS وtau amyloid في التحمضات السائلة طويلة العمر، وحددنا بعض العوامل الرئيسية التي تؤدي إلى التجميع المشترك لهذين البروتينين في مثل هذه التكسرات.نحن هنا نصف بالتفصيل هذه العملية، وهي آلية جزيئية محتملة تكمن وراء التوطين المشترك لبروتينين في الادراج الخاصة بمرض معين.
يحتوي αS على ذيل طرفي C أنيوني للغاية عند درجة حموضة محايدة (الشكل 1 أ) ، وافترضنا أنه يمكن أن يخضع لـ LLPS من خلال تكثيف المجمعات الكهروستاتيكية مع جزيئات البولي ببتيد المضطربة متعددة الأيونات.استخدمنا 100 بقايا بولي-L-يسين (pLK) كجزيء نموذجي أولي نظرًا لطبيعته البوليمرية الموجبة الشحنة والمضطربة عند درجة الحموضة المحايدة 32. أولاً، أكدنا أن pLK يتفاعل مع مجال Ct لـ αS عبر التحليل الطيفي للرنين المغناطيسي النووي (NMR). (الشكل 1ب) باستخدام 13C/15N المسمى αS في وجود زيادة αS:pLK النسب المولية.يتجلى تفاعل pLK مع مجال Ct لـ αS في اضطرابات التحول الكيميائي وانخفاض شدة الذروة في هذه المنطقة من البروتين.ومن المثير للاهتمام أنه عندما قمنا بخلط αS مع pLK بتركيز αS تقريبًا.5-25 ميكرومتر في وجود البولي إيثيلين جلايكول (5-15٪ PEG-8) (المخزن المؤقت LLPS النموذجي: 10 مم HEPES pH 7.4، 100 مم كلوريد الصوديوم، 15٪ PEG-8) مررنا على الفور بمجال واسع من تكوين البروتين .وقد لوحظت القطرات باستخدام المجهر الفلوري (WF) والمجال الساطع (BF) (الشكل 1 ج).قطرات 1-5 ميكرومتر تحتوي على αS مركز (مضاف 1 ميكرومتر AlexaFluor488-labeled αS، AF488-αS)، ويمكن استخلاص خصائصها الكهروستاتيكية من مقاومتها لـ 10٪ 1،6-هيكسانيديول (1،6-HD) وحساسيتها تجاه زيادة في تركيز كلوريد الصوديوم (الشكل 1 ج).تتجلى الطبيعة الشبيهة بالسوائل للمركبات الإلكتروستاتيكية αS / pLK من خلال قدرتها على الاندماج خلال مللي ثانية (الشكل 1 د).باستخدام قياس التعكر، قمنا بتحديد كمية تكوين القطرات في ظل هذه الظروف، وأكدنا الطبيعة الكهروستاتيكية للتفاعل الرئيسي المرتبط بثباتها (الشكل 1 هـ)، وقمنا بتقييم تأثير نسب البوليمر المختلفة على عملية LLPS (الشكل 1f).على الرغم من ملاحظة تكوين القطرات على نطاق واسع من نسب البوليمر، إلا أن العملية تكون مواتية للغاية عندما يتجاوز pLK قيمة αS.وقد لوحظت LLPs أيضًا باستخدام عامل الإزاحة المختلف كيميائيًا ديكستران -70 (70 كيلو دالتون) أو باستخدام مجموعة متنوعة من تنسيقات العينات، بما في ذلك قطرات الشرائح الزجاجية، وآبار الصفيحة الدقيقة من مواد مختلفة، أو شعيرات إيبندورف أو الكوارتز.
تمثيل تخطيطي لمناطق البروتين المختلفة في متغيرات WT-αS وΔCt-αS المستخدمة في هذه الدراسة.يظهر مجال الطرف N amphipathic ومنطقة تكوين الأميلويد الكارهة للماء (NAC) ومجال الطرف C المشحون سالبًا باللون الأزرق والبرتقالي والأحمر على التوالي.يتم عرض خريطة صافي الشحن لكل المتبقي (NCPR) لـ WT-αS.ب تحليل الرنين المغناطيسي النووي للتفاعل αS / pLK في غياب كتل الجزيئات الكبيرة.مع زيادة تركيز pLK (تظهر النسب المولية αS:pLK 1:0.5 و1:1.5 و1:10 باللون الأخضر الفاتح والأخضر والأخضر الداكن على التوالي).c Coacervate αS/pLK (النسبة المولية 1:10) عند 25 ميكرومتر (1 ميكرومتر AF488 المسمى αS أو Atto647N المسمى pLK لتصوير WF) في المخزن المؤقت LLPS (أعلى) أو مكمل بـ 500 ملي مول كلوريد الصوديوم (أسفل اليسار) أو بعد 10 % 1,6-هيكسانديول (1,6-HD؛ أسفل اليمين).شريط النطاق = 20 ميكرومتر.د صور مجهرية تمثيلية لاندماج قطيرات BF لـ αS / pLK (نسبة المولي 1:10) بتركيز 25 ميكرومتر ؛تشير الأسهم إلى دمج القطرات الفردية (الأسهم الحمراء والصفراء) في قطرة جديدة (السهم البرتقالي) خلال 200 مللي ثانية).شريط النطاق = 20 ميكرومتر.e تشتت الضوء (عند 350 نانومتر) تجميع αS / pLK في المخزن المؤقت LLPS قبل وبعد إضافة 500 ملي مولار كلوريد الصوديوم أو 10٪ 1،6-HD عند 25 ميكرومتر αS (N = 3 عينة متماثلة، يشار أيضًا إلى الانحراف المتوسط ​​والمعياري).f صورة BF (أعلى) وتحليل تشتت الضوء (عند 350 نانومتر، أسفل) لتجميع αS / pLK عند 25 ميكرومتر αS مع زيادة نسبة المولي αS: pLK (N = 3 تكرارات للعينة، كما تمت الإشارة إلى الانحراف المتوسط ​​والمعياري).شريط النطاق = 10 ميكرومتر.يشير شريط المقياس الموجود في إحدى الصور إلى حجم جميع الصور في لوحة واحدة.يتم توفير البيانات الأولية في شكل ملفات بيانات أولية.
استنادًا إلى ملاحظاتنا حول التكثيف المعقد الكهروستاتيكي αS/pLK والملاحظات السابقة لـ αS كجزيء عميل لمكثفات tau/RNA من خلال التفاعل المباشر مع tau31، افترضنا أن αS وtau يمكن أن يشتركا في الفصل مع المذيب في غياب RNA تركيز.من خلال المجمعات الكهروستاتيكية، وαS هو بروتين السقالة في αS/Tau coacervates (انظر توزيع شحنة tau في الشكل 2e).لاحظنا أنه عندما تم خلط 10 ميكرومتر αS و10 ميكرومتر Tau441 (يحتوي على 1 ميكرومتر AF488-αS و1 ميكرومتر Atto647N-Tau، على التوالي) معًا في المخزن المؤقت LLPS، فقد شكلوا بسهولة مجاميع بروتين تحتوي على كلا البروتينين، كما يتضح من الفحص المجهري WF.(الشكل 2 أ).تم تأكيد التوطين المشترك للبروتينين في القطرات بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر (CF) (الشكل التكميلي 1 أ).ولوحظ سلوك مماثل عند استخدام ديكستران -70 كعامل تجميع (الشكل التكميلي 1 ج).باستخدام PEG المسمى FITC أو ديكستران، وجدنا أن كلا من عوامل الازدحام تم توزيعها بالتساوي عبر العينات، ولم تظهر أي فصل أو ارتباط (الشكل التكميلي 1 د).بدلاً من ذلك، فإنه يشير إلى أنهم في هذا النظام يعززون فصل الطور من خلال تأثيرات الازدحام الجزيئي، نظرًا لأن PEG هو عامل ازدحام مستقر بشكل تفضيلي، كما هو موضح في أنظمة LLP الأخرى.كانت هذه القطرات الغنية بالبروتين حساسة لـ NaCl (1 M) ولكن ليس لـ 1،6-HD (10٪ حجم / حجم)، مما يؤكد خصائصها الكهروستاتيكية (الشكل التكميلي 2 أ، ب).تم تأكيد سلوكهم السائل من خلال مراقبة أحداث القطرات المدمجة بالمللي ثانية باستخدام الفحص المجهري BF (الشكل 2 ب).
صور مجهرية متحد البؤر (CF) لـ αS / Tau441 تتجمع في المخزن المؤقت LLPS (10 ميكرومتر من كل بروتين ، 0.5 ميكرومتر من αS المسمى AF488 و Tau441 المسمى Atto647N).ب صور تباين التداخل التفاضلي التمثيلي (DIC) لأحداث دمج القطرات αS / Tau441 (10 ميكرومتر لكل بروتين).c مخطط الطور يعتمد على تشتت الضوء (عند 350 نانومتر) لـ Tau441 LLPS (0–15 ميكرومتر) في غياب (يسار) أو وجود (يمين) 50 ميكرومتر αS.تشير الألوان الأكثر دفئًا إلى مزيد من التشتت.د تشتت الضوء لعينات αS / Tau441 LLPS مع زيادة تركيز αS (Tau441 عند 5 ميكرومتر ، N = 2–3 تكرار العينة كما هو محدد).e تمثيل تخطيطي لبعض متغيرات بروتين تاو ومناطق مختلفة من البروتين المستخدم في هذه الدراسة: مجال الطرف N سالب الشحنة (أحمر)، المنطقة الغنية بالبرولين (أزرق)، مجال ربط الأنابيب الدقيقة (MTBD، مظلل باللون البرتقالي)، و دوامة زوجية مكونة للأميلويد.مناطق الشعيرة (PHF) الموجودة داخل MTBD (الرمادي).تظهر خريطة صافي الرسوم لكل بقايا (NCPR) لـ Tau441.f باستخدام 1 ميكرومتر αS المسمى AF488 و ΔNt- المسمى Atto647N ، باستخدام 1 ميكرومتر AF488 المسمى αS أو ΔCt-αS في وجود ΔNt-Tau (أعلى ، 10 ميكرومتر لكل بروتين) أو K18 (أسفل ، 50 ميكرومتر لكل بروتين) ) ) ) صورة مجهرية لـ WF مكثفة في المخزن المؤقت LLPS أو K18.تمثل أشرطة المقياس في صورة واحدة حجم جميع الصور في لوحة واحدة (20 ميكرومتر للوحات a وb وf).يتم توفير البيانات الأولية للوحات c و d كملفات بيانات أولية.
لاختبار دور αS في عملية LLPS هذه، قمنا أولاً بالتحقق من تأثير αS على ثبات القطرات عن طريق قياس الكلى باستخدام تركيزات متزايدة من NaCl (الشكل 2 ج).كلما زاد تركيز الملح في العينات التي تحتوي على αS، زادت قيم تشتت الضوء (عند 350 نانومتر)، مما يشير إلى الدور التثبيتي لـ αS في نظام LLPS هذا.يمكن ملاحظة تأثير مماثل عن طريق زيادة تركيز αS (وبالتالي نسبة αS:Tau441) إلى تقريبًا.زيادة بمقدار 10 أضعاف مقارنة بتركيز تاو (5 ميكرومتر) (الشكل 2 د).لإثبات أن αS عبارة عن بروتين سقالة في coacervates، قررنا التحقيق في سلوك متحولة Tau المعطل بـ LLPS، والذي يفتقر إلى منطقة N-terminal مشحونة سالبًا (البقايا 1–150، انظر الشكل 2e) والتي تسمى ΔNt-Tau.أكد الفحص المجهري وقياس الكلى من WF أن ΔNt-Tau نفسه لم يخضع لـ LLPS (الشكل 2f والشكل التكميلي 2d)، كما ورد سابقًا 14. ومع ذلك، عندما تمت إضافة αS إلى محاليل التشتت لمتغير Tau المبتور هذا، كانت عملية LLPS كاملة تمت استعادته بكثافة قطرات قريبة من كثافة قطرات المحاليل كاملة الحجم لـ Tau و αS في ظل ظروف مماثلة وتركيزات البروتين.ويمكن أيضًا ملاحظة هذه العملية في ظل ظروف الازدحام الجزيئي المنخفض (الشكل التكميلي 2 ج).تم توضيح دور منطقة αS للمحطة C، ولكن ليس طولها بالكامل، في عملية LLPS من خلال تثبيط تكوين القطرات باستخدام متغير αS للمحطة C الذي يفتقر إلى المخلفات 104-140 (الشكل 1 أ) من (ΔCt- αS) البروتين (الشكل 2f والشكل التكميلي 2d).تم تأكيد التركيز المشترك لـ αS و ΔNt-Tau بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر (الشكل التكميلي 1 ب).
لمزيد من اختبار آلية LLPS بين Tau441 وαS، تم استخدام متغير Tau إضافي، وهو الجزء الأساسي من الخيوط الحلزونية المقترنة (PHF) في مجال ربط الأنابيب الدقيقة (MTBD)، والذي إذا كان يحتوي على أربعة مجالات تكرار مميزة، والمعروف أيضًا مثل الجزء K18 (انظر الشكل 2 هـ).تم الإبلاغ مؤخرًا عن أن αS يرتبط بشكل تفضيلي ببروتين تاو الموجود في مجال غني بالبرولين في تسلسل يسبق مجال ربط الأنابيب الدقيقة.ومع ذلك، فإن منطقة PHF غنية أيضًا بالمخلفات الموجبة الشحنة (انظر الشكل 2 هـ)، وخاصة الليسين (بقايا 15٪)، مما دفعنا إلى اختبار ما إذا كانت هذه المنطقة تساهم أيضًا في تكثيف مجمع αS/Tau.لاحظنا أن K18 وحده لا يمكن أن يؤدي إلى LLPS بتركيزات تصل إلى 100 ميكرومتر في ظل الظروف التي تم اختبارها (المخزن المؤقت LLPS مع 15٪ PEG أو 20٪ ديكستران) (الشكل 2f).ومع ذلك ، عندما أضفنا 50 ميكرومتر αS إلى 50 ميكرومتر K18 ، تمت ملاحظة التكوين السريع لقطرات البروتين التي تحتوي على K18 و αS بواسطة قياس الكلى (الشكل التكميلي 2 د) والمجهر WF (الشكل 2f).كما هو متوقع ، لم يكن ΔCt-αS قادرًا على استعادة سلوك LLPS لـ K18 (الشكل 2f).نلاحظ أن تجميع αS/K18 يتطلب تركيزات بروتين أعلى قليلاً للحث على LLPS مقارنة بـ αS/ΔNt-Tau أو αS/Tau441، مع تساوي الأمور الأخرى.وهذا يتوافق مع تفاعل أقوى لمنطقة الطرف αS C مع مجال تاو الغني بالبرولين مقارنة بمجال ربط الأنابيب الدقيقة، كما هو موضح سابقًا 31.
نظرًا لأن ΔNt-Tau لا يمكنه أداء LLPS في غياب αS، فقد اخترنا متغير Tau هذا كنموذج لتوصيف αS/Tau LLPS نظرًا لبساطته في أنظمة LLPS ذات الطول الكامل Tau (النمط المتماثل، Tau441/Tau441).مع عمليات التجميع المعقدة (غير المتجانسة، αS/Tau441).قارنا درجة تجميع αS (كجزء من بروتين الطور المكثف، fαS، c) في أنظمة αS/Tau وαS/ΔNt-Tau عن طريق الطرد المركزي وتحليل الطور المشتت SDS-PAGE (انظر 2e)، ووجدنا قيمًا متشابهة جدًا لجميع البروتينات بنفس التركيز.على وجه الخصوص، حصلنا على fαS,c 84 ± 2% و79 ± 7% لـ αS/Tau وαS/ΔNt-Tau، على التوالي، مما يشير إلى أن التفاعل غير المتجانس بين αS وtau يتفوق على التفاعل بين جزيئات tau.بين.
تمت دراسة التفاعل مع polycations المختلفة وتأثير عملية التكثيف على حركية αS لأول مرة من خلال طريقة استعادة التألق بعد التبييض الضوئي (FRAP).قمنا باختبار αS / Tau441 و αS / ΔNt-Tau و αS / pLK (100 ميكرومتر αS مكملة بـ 2 ميكرومتر αS AF488-αS و 100 ميكرومتر Tau441 أو ΔNt-Tau أو 1 مم pLK).تم الحصول على البيانات خلال الـ 30 دقيقة الأولى بعد خلط مكونات العينة.من صور FRAP التمثيلية (الشكل 3 أ، تكثيف αS / Tau441) ومنحنيات الدورة الزمنية المقابلة لها (الشكل 3 ب، الشكل التكميلي 3)، يمكن ملاحظة أن حركية αS تشبه إلى حد كبير حركيات Tau441.وΔNt-Tau، وهو أسرع بكثير مع pLK.معاملات الانتشار المحسوبة لـ αS داخل coacervate وفقًا لـ FRAP (كما وصفها Kang et al. 35) هي D = 0.013 ± 0.009 μm2/s وD = 0.026 ± 0.008 μm2/s لـ αS/Tau441 و αS/ΔNt- لـ النظام αS/pLK وTau وD = 0.18 ± 0.04 μm2/s، على التوالي (الشكل 3 ج).ومع ذلك ، فإن معامل الانتشار αS في الطور المشتت أعلى بعدة أوامر من جميع المراحل المكثفة ، على النحو الذي يحدده التحليل الطيفي للارتباط الفلوري (FCS ، انظر الشكل التكميلي 3) في ظل نفس الظروف (LLPS buffer) ولكن في حالة عدم وجود polycations (د = 8 ± 4 ميكرومتر2/ثانية).لذلك، يتم تقليل حركية ترجمة αS بشكل كبير في الكوسرفات مقارنة بالبروتينات في الطور المشتت بسبب تأثيرات الازدحام الجزيئي الواضحة، على الرغم من أن جميع الكوسرفات تحتفظ بخصائص تشبه السائل خلال النصف ساعة الأولى بعد تكوينها، على عكس مرحلة تاو.حركية أسرع في مكثفات pLK.
تحليل a - c FRAP لديناميات αS (2٪ AF488 المسمى αS) في التآكل الكهروستاتيكي.تظهر الصور التمثيلية لفحوصات αS/Tau441 FRAP في ثلاث نسخ في (أ)، حيث تشير الدوائر الحمراء إلى المناطق التي تم إزالة اللون منها.شريط النطاق هو 5 ميكرون.ب متوسط ​​منحنيات FRAP و (ج) معاملات الانتشار المحسوبة (D) لقطرات مختلفة من 5 إلى 6 (N) من ثلاث تجارب باستخدام 100 ميكرومتر αS وتركيزات متساوية الأضلاع من Tau441 (أحمر) أو ΔNt-Tau (أزرق) أو pLK (أخضر) بعشرة أضعاف تركيز LLPS.يظهر الانحراف المعياري لمنحنى FRAP باللون المظلل.للمقارنة، تم تحديد معامل الانتشار αS في الطور المشتت في ثلاث نسخ باستخدام التحليل الطيفي للارتباط الفلوري (FCS) (انظر الشكل التكميلي 3 وطرق لمزيد من المعلومات).d أطياف EPR المستمرة لنطاق X تبلغ 100 ميكرومتر TEMPOL-122-αS في المخزن المؤقت LLPS دون أي تعدد (أسود) أو في وجود 100 ميكرومتر Tau441 (أحمر) أو ΔNt-Tau (أزرق) أو 1 مم pLK (أخضر).يُظهر الشكل الداخلي منظرًا مكبرًا لخطوط المجال القوية حيث تحدث التغييرات الأكثر دراماتيكية.e منحنيات ملزمة تبلغ 50 ميكرومتر TEMPOL-122-αS مع العديد من التعددات في غياب LLPS (بدون PEG).يظهر انخفاض السعة للنطاق III مقارنة بالنطاق II (IIII/III) من طيف EPR الطبيعي لزيادة النسب المولية لـ Tau441 (الأحمر)، ΔNt-Tau (الأزرق) وpLK (الأخضر).تظهر الخطوط الملونة ملاءمة للبيانات باستخدام نموذج ربط تقريبي مع عدد n من مواقع الربط المتطابقة والمستقلة على كل منحنى.يتم توفير البيانات الأولية في شكل ملفات بيانات أولية.
كتكملة، قمنا بدراسة ديناميكيات αS في العديد من الكواتسرفات باستخدام وضع العلامات الدورانية الموجهة (SDSL) والرنين المغنطيسي الإلكتروني المستمر (CW-EPR).لقد أثبتت هذه الطريقة أنها مفيدة جدًا في الإبلاغ عن مرونة وديناميكيات النازحين داخليًا من خلال دقة متبقية واقعية 36،37،38.تحقيقًا لهذه الغاية، قمنا ببناء بقايا السيستين في طفرات Cys المفردة واستخدمنا مسبار الدوران 4-هيدروكسي-2،2،6،6-رباعي ميثيل بيبريدين-N-أوكسيل (TEMPOL).تسميها مشتقات الماليميد.وبشكل أكثر تحديدًا، قمنا بإدراج تحقيقات TEMPOL في الموضع 122 أو 24 αS (TEMPOL-122-αS وTEMPOL-24-αS).في الحالة الأولى، نستهدف المنطقة الطرفية C من البروتين، والتي تشارك في التفاعل مع التعددات.وبدلاً من ذلك، يمكن للموضع 24 أن يزودنا بمعلومات حول الديناميكيات العامة للبروتينات الموجودة في المكثفات.في كلتا الحالتين، تتوافق إشارات EPR التي تم الحصول عليها لبروتينات الطور المشتت مع جذور النيتروكسيد في حالة الحركة السريعة.بعد فصل الطور في وجود tau أو pLK (100 ميكرومتر TEMPOL-αS أو Tau441 أو ΔNt-Tau بنسبة 1:1 أو pLK بنسبة 1:10)، لوحظت زيادة في شدة الذروة النسبية في طيف EPR لـ αS.اتسع خط الخسارة، مما يشير إلى انخفاض حركية إعادة توجيه αS في القطرات مقارنة بالبروتين في الطور المخفف (الشكل ثلاثي الأبعاد، الشكل التكميلي 4 أ).تكون هذه التغييرات أكثر وضوحًا في الموضع 122. بينما في الموضع 24 لم يؤثر وجود pLK على حركية المسبار، في الموضع 122 تغير شكل الخط الطيفي بشكل ملحوظ (الشكل التكميلي 4 أ).عندما حاولنا نمذجة الأطياف في الموضع 122 لنظامين αS/polycation باستخدام النموذج المتناحي (الشكل التكميلي 5 أ) المستخدم بشكل شائع لوصف ديناميكيات IDP38،39 المسمى بالدوران، لم نتمكن من إعادة بناء الأطياف التجريبية..تتناقض المحاكاة الطيفية لموضع 24 دورة (الشكل التكميلي 5 أ).يشير هذا إلى وجود مواقع تفضيلية في مساحة تكوينات الدوران لمنطقة الطرف C لـ αS في وجود polycations.عند النظر في جزء αS في الطور المكثف في ظل ظروف EPR التجريبية (84 ± 2%، 79 ± 7%، و47 ± 4% لـ αS/Tau441، αS/ΔNt-Tau، و αS/pLK، على التوالي - انظر التكميلي الشكل 2 هـ من تحليل البيانات ج)، يمكن ملاحظة أن التوسيع الذي تم اكتشافه بواسطة طريقة EPR يعكس بشكل أساسي تفاعل منطقة الطرف C لـ αS مع العديد من التعددات في الطور المكثف (التغيير الرئيسي عند استخدام TEMPOL-122- αS)، وليس تكثيف البروتين.لوحظت زيادة في اللزوجة الدقيقة في المسبار.كما هو متوقع ، تمت استعادة طيف EPR للبروتين تحت ظروف أخرى غير LLPS بالكامل عند إضافة 1 M NaCl إلى الخليط (الشكل التكميلي 4 ب).بشكل عام، تشير بياناتنا إلى أن التغييرات التي اكتشفها CW-EPR تعكس بشكل أساسي تفاعل منطقة الطرف C لـ αS مع العديد من التعددات في الطور المكثف، ويبدو أن هذا التفاعل أقوى مع pLK منه مع Tau.
من أجل الحصول على مزيد من المعلومات الهيكلية حول البروتينات الموجودة في coacervate، قررنا دراسة نظام LLPS باستخدام الرنين المغناطيسي النووي في المحلول.ومع ذلك، لا يمكننا اكتشاف سوى جزء αS المتبقي في الطور المشتت، والذي قد يكون بسبب انخفاض ديناميكيات البروتين داخل الكوسيرفات والمرحلة الكثيفة في الجزء السفلي من الحل في تحليل الرنين المغناطيسي النووي.عندما قمنا بتحليل بنية وديناميكيات البروتين المتبقي في الطور المشتت لعينة LLPS باستخدام الرنين المغناطيسي النووي (الشكل التكميلي 5 ج، د)، لاحظنا أن البروتين يتصرف بشكل متطابق تقريبًا في وجود pLK وΔNt-Tau، وكلاهما والتي كانت في البنية الثانوية وديناميكيات العمود الفقري للبروتين، والتي كشفت عنها تجارب التحول الكيميائي الثانوي واسترخاء R1ρ.تظهر بيانات الرنين المغناطيسي النووي أن الطرف C لـ αS يعاني من خسارة كبيرة في المرونة المطابقة مع الاحتفاظ بطبيعته المضطربة، مثل بقية تسلسل البروتين، بسبب تفاعلاته مع polycations.
نظرًا لأن توسيع إشارة CW-EPR الذي لوحظ في المرحلة المكثفة TEMPOL-122-αS يعكس تفاعل البروتين مع polycations، فقد أجرينا معايرة EPR لتقييم تقارب الارتباط لـ αS مع polycations المختلفة في غياب LLPS (لا يوجد تراكم Buffer LLPS) ، مما يشير إلى أن التفاعلات هي نفسها في المراحل المخففة والمركزة (وهو ما تؤكده بياناتنا والشكل التكميلي 4 أ والشكل التكميلي 6).كان الهدف هو معرفة ما إذا كانت جميع المواد المتجمعة، على الرغم من خصائصها المشتركة الشبيهة بالسوائل، تظهر أي سلوك تفاضلي أساسي على المستوى الجزيئي.كما هو متوقع، اتسع طيف EPR مع زيادة تركيز التعدد، مما يعكس انخفاضًا في المرونة الجزيئية بسبب التفاعلات الجزيئية لجميع شركاء التفاعل حتى التشبع تقريبًا (الشكل 3 هـ، الشكل التكميلي 6).حقق pLK هذا التشبع بنسبة مولية أقل (polycation: αS) مقارنة بـ ΔNt-Tau وTau441.في الواقع، أظهرت مقارنة البيانات مع نموذج ربط تقريبي بافتراض n مواقع ربط متطابقة ومستقلة أن ثابت التفكك الظاهر لـ pLK (~5 ميكرومتر) هو ترتيب من حيث الحجم أقل من Tau441 أو ΔNt-Tau (~50 ميكرومتر) ).ميكرومتر).على الرغم من أن هذا تقدير تقريبي، إلا أن هذا يشير إلى أن αS لديه تقارب أعلى للتعددات الأبسط مع مناطق الشحنة الإيجابية المستمرة.نظرًا لهذا الاختلاف في التقارب بين αS ومختلف التعددات، افترضنا أن خواصها السائلة قد تتغير بشكل مختلف بمرور الوقت وبالتالي تعاني من عمليات LSPT المختلفة.
نظرًا للبيئة المزدحمة للغاية داخل بروتين coacervate وطبيعة البروتين الأميلويد، لاحظنا سلوك coacervate مع مرور الوقت للكشف عن عمليات LSPT المحتملة.باستخدام المجهر BF وCF (الشكل 4)، لاحظنا أن αS/Tau441 يتراكم إلى حد كبير في المحلول، مما يشكل قطرات كبيرة تتلامس وتبلل السطح في الجزء السفلي من البئر/الشريحة كقطرات كاملة، كما هو متوقع (الشكل التكميلي .7 د)؛نحن نسمي هذه الهياكل ذات الشكل السفلي "طوافات البروتين".ظلت هذه الهياكل سائلة لأنها احتفظت بالقدرة على الاندماج (الشكل التكميلي 7 ب) ويمكن رؤيتها لعدة ساعات بعد تشغيل LLPS (الشكل 4 والشكل التكميلي 7 ج).لاحظنا أن عملية الترطيب مفضلة على سطح المواد المحبة للماء بدلاً من المواد الكارهة للماء (الشكل التكميلي 7 أ) ، كما هو متوقع بالنسبة للكهرباء الساكنة ذات الشحنات غير المتوازنة وبالتالي إمكانات السطح الكهروستاتيكية العالية.والجدير بالذكر أنه تم تقليل التحام αS/ΔNt-Tau والتجديف بشكل كبير، في حين تم تقليل مكثفات αS/pLK بشكل كبير (الشكل 4).خلال فترة الحضانة القصيرة، تمكنت قطرات αS/pLK من الاندماج وتبليل السطح المحب للماء، لكن هذه العملية توقفت بسرعة وبعد 5 ساعات من الحضانة، تمت ملاحظة أحداث التحام محدودة فقط ولم تتم ملاحظة أي ترطيب.– انتقال هلام بالتنقيط.
تمثيل BF (الألواح ذات التدرج الرمادي) وCF (الألواح اليمنى، AF488 المسمى αS باللون الأخضر) لعينات coacervate التي تحتوي على 100 ميكرومتر αS (ملصق الفلورسنت 1٪) في المخزن المؤقت LLPS في وجود 100 ميكرومتر Tau441 (أعلى) مضان) صور مجهرية ΔNt -Tau (وسط) أو 1 مم pLK (أسفل) في أوقات حضانة مختلفة وارتفاعات بؤرية (z، المسافة من أسفل اللوحة جيدًا).تم تكرار التجارب 4-6 مرات بشكل مستقل عن بعضها البعض مع نفس النتائج.يتم ترطيب تضافرات αS/Tau441 بعد 24 ساعة، لتشكل أطوافًا أكبر من الصورة.شريط النطاق لجميع الصور هو 20 ميكرومتر.
ثم سألنا ما إذا كانت مجموعات البروتين الكبيرة التي تشبه السوائل والتي تشكلت في αS/Tau441 LLPS ستؤدي إلى تراكم الأميلويد في أي من البروتينات التي تمت دراستها.لقد تابعنا نضوج قطرات αS / Tau441 مع مرور الوقت باستخدام المجهر WF في ظل نفس الظروف المذكورة أعلاه، ولكن باستخدام 1 ميكرومتر AF488 المسمى αS وAtto647N المسمى Tau441 (الشكل 5 أ).كما هو متوقع، لاحظنا توطين البروتين الكامل طوال عملية النضج.ومن المثير للاهتمام، من كاليفورنيا.بعد 5 ساعات، لوحظت هياكل غير دائرية أكثر كثافة داخل الطوافات، والتي أطلقنا عليها اسم "النقاط"، والتي تم تنسيق بعضها مع αS، وتم إثراؤها في Tau441 (الشكل 5 أ، الأسهم البيضاء).لقد تمت ملاحظة هذه البقع دائمًا داخل الطوافات إلى حد أكبر بالنسبة لـ αS / ΔNt-Tau مقارنةً بـ αS / ΔNt-Tau.لم تكن هناك نقاط مميزة في قطرات أنظمة pLK وTau غير القادرة على الاندماج/الترطيب.لاختبار ما إذا كانت هذه البقع التي تحتوي على αS وTau441 عبارة عن مجاميع تشبه الأميلويد، أجرينا تجربة مماثلة باستخدام المجهر CF حيث تمت إضافة Tau441 بـ Atto647N و12.5 ميكرومتر من الثيوفلافين-T (ThT) الخاص بالأميلويد منذ البداية.صبغ.على الرغم من عدم ملاحظة تلطيخ ThT لقطرات أو أطواف αS / Tau441 حتى بعد 24 ساعة من الحضانة (الشكل 5 ب ، الصف العلوي - القطرات المتبقية فوق أطواف البروتين) ، كانت الهياكل الإيجابية لـ ThT التي تحتوي على Atto647N-Tau441 داخل الأطواف ضعيفة جدًا.وهذا يكرر حجم البقع الموصوفة مسبقًا وشكلها وموقعها (الشكل 5 ب، الصفوف الوسطى والسفلية)، مما يشير إلى أن البقع قد تتوافق مع مجاميع تشبه الأميلويد تتشكل في تكثف السوائل المتقادمة.
WF 25 ميكرومتر αS في أوقات حضانة مختلفة وارتفاعات بؤرية (z، المسافة من القاع غير المحدود) في وجود 25 ميكرومتر Tau441 (1 ميكرومتر AF488 المسمى αS وAtto647N المسمى Tau441) في بئر لوحة المجهر مع المخزن المؤقت LLPS) .تم تكرار ست تجارب بشكل مستقل مع نتائج مماثلة.ب صورة مجهرية CF تبلغ 25 ميكرومتر αS في وجود 25 ميكرومتر Tau441 (1 ميكرومتر Atto647N المسمى Tau441) و 12.5 ميكرومتر ثيوفلافين-T (ThT).تظهر قطرات البروتين الموزونة وطوافات البروتين المودعة والبقع في الصفين العلوي والوسطى، على التوالي.يعرض الصف السفلي صورًا للطوافات والقطرات من 3 مكررات مستقلة.تشير الأسهم البيضاء إلى نقاط ThT الإيجابية في كلا الفريقين.شريط النطاق لجميع الصور هو 20 ميكرومتر.
لفحص التغييرات في شبكة بروتين coacervate بمزيد من التفصيل أثناء الانتقال من السائل إلى الصلب ، استخدمنا التصوير الفلوري مدى الحياة (FLIM) والمجهر المجهري لنقل طاقة الرنين Förster (FRET) (الشكل 6 والأرقام التكميلية 8 و 9).لقد افترضنا أن نضج الطبقة المتماسكة إلى بنية بروتينية مجمعة أكثر تكثيفًا أو حتى تشبه الصلبة يؤدي إلى اتصال أوثق بين البروتين ومسبار الفلورسنت المرتبط به، مما قد ينتج عنه تأثير تبريد يتجلى في عمر مسبار قصير (τ) كما هو موضح سابقًا40.,41,42.بالإضافة إلى ذلك، بالنسبة للعينات ذات العلامات المزدوجة (AF488 وAtto647N كأصباغ مانحة ومتقبلة لـ FRET، على التوالي)، يمكن أيضًا أن يكون هذا النقصان في τ مصحوبًا بتكثيف coacervate وزيادة في كفاءة FRET (E) أثناء LSPT.قمنا بمراقبة تكوين الطوافة والبقع مع مرور الوقت في عينات LLPS αS/Tau441 وαS/ΔNt-Tau (25 ميكرومتر من كل بروتين في المخزن المؤقت LLPS الذي يحتوي على 1 ميكرومتر AF488 المسمى αS و/أو Atto647N المسمى Tau441 أو ΔNt-Tau).لاحظنا اتجاهًا عامًا يتمثل في أن عمر مضان تحقيقات AF488 (τ488) و Atto647N (τ647N) انخفض بشكل طفيف مع نضوج coacervates (الشكل 6 والشكل التكميلي 8c).ومن المثير للاهتمام، أن هذا التغيير تم تعزيزه بشكل كبير بالنسبة للنقاط الموجودة داخل الطوافات (الشكل 6 ج)، مما يشير إلى حدوث مزيد من تكثيف البروتين عند النقاط.دعماً لهذا، لم يلاحظ أي تغيير كبير في عمر التألق بالنسبة لقطرات αS/ΔNt-Tau التي يبلغ عمرها 24 ساعة (الشكل التكميلي 8 د)، مما يشير إلى أن تكوين القطرات هو عملية متميزة عن التبقع ولا يصاحبها إعادة تنظيم جزيئي كبيرة داخل كوسيرفاتس.تجدر الإشارة إلى أن النقاط لها أحجام مختلفة ومحتوى متغير في αS، خاصة بالنسبة لنظام αS/Tau441 (الشكل التكميلي 8e).كان الانخفاض في عمر التألق الموضعي مصحوبًا بزيادة في الشدة، خاصة بالنسبة لـ Atto647N المسمى Tau441 (الشكل التكميلي 8 أ)، وكفاءة FRET أعلى لكل من أنظمة αS/Tau441 وαS/ΔNt-Tau، مما يشير إلى مزيد من التكثيف في LLPS خمس ساعات بعد التحفيز، تتكثف البروتينات الموجودة داخل الكهرباء الساكنة.بالمقارنة مع αS / ΔNt-Tau، لاحظنا قيم τ647N أقل وقيم τ488 أعلى إلى حد ما في بقع αS / Tau441، مصحوبة بقيم FRET أقل وأكثر تجانسًا.من المحتمل أن يكون هذا مرتبطًا بحقيقة أنه في نظام αS / Tau441، تكون وفرة αS المرصودة والمتوقعة في المجاميع أكثر تجانسًا، وغالبًا ما تكون دون المستوى مقارنة بـ Tau، نظرًا لأن Tau441 نفسه قد يخضع أيضًا لـ LLPS والتجميع (الشكل التكميلي 8e) .ومع ذلك، فإن درجة اندماج القطرات، وتكوين الطوافة، والأهم من ذلك، تجميع البروتين داخل coacervates الشبيهة بالسائل هي الحد الأقصى عند وجود كل من Tau441 وαS.
صور مجهرية مضان مدى الحياة (FLIM) لـ αS / Tau441 و αS / ΔNt-Tau عند 25 ميكرومتر من كل بروتين (1 ميكرومتر AF488 المسمى αS و 1 ميكرومتر Atto647N المسمى Tau441 أو ΔNt-Tau) في المخزن المؤقت LLPS.تُظهر الأعمدة صورًا تمثيلية لعينات LLPS في أوقات نضج مختلفة (30 دقيقة و5 ساعات و24 ساعة).يُظهر الإطار الأحمر المنطقة التي تحتوي على نقاط αS/Tau441.تظهر فترات الحياة كأشرطة ملونة.شريط المقياس = 20 ميكرومتر لجميع الصور.ب صورة مكبرة FLIM للمنطقة المحددة، كما هو موضح في المربع الأحمر في اللوحة أ.يتم عرض نطاقات الحياة باستخدام نفس مقياس الألوان كما في اللوحة أ.شريط النطاق = 5 ميكرومتر.c رسوم بيانية تظهر AF488 (مرتبط بـ αS) أو Atto647N (مرفق بـ Tau) لأنواع مختلفة من البروتين (قطرات-D- و raft-R- و رقطة-P) المحددة في صور FLIM المسجلة لتوزيعات التوقيت αS-) عمر Tau441 و عينات αS/ΔNt-Tau تتكثف (N = 17-32 عائد الاستثمار لـ D، 29-44 عائد الاستثمار لـ R، و21-51 عائد الاستثمار للنقاط).تظهر القيم المتوسطة والمتوسط ​​كمربعات صفراء وخطوط سوداء داخل الصناديق، على التوالي.تمثل الحدود الدنيا والعليا للمربع الربعين الأول والثالث، على التوالي، وتظهر القيم الدنيا والقصوى ضمن النطاق الرباعي 1.5 أضعاف (IQR) كشعيرات.وتظهر القيم المتطرفة كالماس الأسود.تم تحديد الأهمية الإحصائية بين أزواج التوزيعات باستخدام اختبار t لعينتين، على افتراض وجود تباينات غير متكافئة.يتم عرض القيم p لاختبار t ثنائي الذيل مع العلامات النجمية لكل زوج من البيانات المقارنة (* قيمة p > 0.01، ** قيمة p > 0.001، *** قيمة p > 0.0001، **** القيمة p > 0.00001)، ns تشير إلى الإهمال (القيمة p > 0.05).وترد القيم p الدقيقة في الجدول التكميلي 1، ويتم تقديم البيانات الأصلية كملفات بيانات أولية.
ولتوضيح طبيعة البقع/المجاميع التي تشبه الأميلويد بشكل أكبر، قمنا بمعالجة عينات من التحمض غير الملوث لمدة 24 ساعة بتركيزات عالية من (1 م) كلوريد الصوديوم، مما أدى إلى فصل الركام عن تحمض البروتين.عندما تمت ملاحظة الركام المعزول (أي محلول مشتت من الركام) باستخدام مجهر القوة الذرية (AFM)، لاحظنا شكلًا كرويًا في الغالب بارتفاع منتظم يبلغ حوالي 15 نانومتر، والذي يميل إلى الارتباط في ظل ظروف تركيز الملح العالي، على غرار سلوك ألياف ليفية الأميلويد النموذجية بسبب التأثير القوي الكاره للماء على السطح (لاحظ أن الألياف عادة ما يكون ارتفاعها حوالي 10 نانومتر) (الشكل التكميلي 10 أ).ومن المثير للاهتمام أنه عندما تم تحضين المجاميع المعزولة باستخدام ThT في اختبار مضان ThT قياسي، لاحظنا زيادة كبيرة في إنتاجية الكم مضان ThT، مماثلة لتلك التي لوحظت عندما تم تحضين الصبغة باستخدام ألياف أميلويد αS النموذجية (الشكل التكميلي 10 ب) ، مما يشير إلى ذلك تحتوي مجاميع coacervate على هياكل تشبه الأميلويد..في الواقع ، كانت الركام متسامحة مع تركيزات الملح العالية ولكنها حساسة لكلوريد الجوانيدين 4 م (GdnHCl) ، مثل ألياف الأميلويد النموذجية (الشكل التكميلي 10 ج).
بعد ذلك، قمنا بتحليل تكوين المجاميع باستخدام مضان جزيء واحد، ومطياف الارتباط / الارتباط المتبادل المحدد (FCS / FCCS)، وتحليل الاندفاع للكشف عن الصدفة بلونين (TCCD).تحقيقًا لهذه الغاية ، قمنا بعزل المجاميع المتكونة بعد 24 ساعة من الحضانة في 100 ميكرولتر من عينات LLPS التي تحتوي على αS و Tau441 (كلاهما 25 ميكرومتر) مع 1 ميكرومتر AF488 المسمى αS و 1 ميكرومتر Atto647N المسمى Tau441.تمييع الحل الكلي المشتت الناتج إلى حالة أحادية الجزيئية باستخدام نفس المخزن المؤقت الخالي من PEG و1 M NaCl (نفس المخزن المؤقت المستخدم لفصل المجاميع عن coacervate) لمنع أي تفاعلات إلكتروستاتية محتملة بين LLPS والبروتين.يمكن رؤية مثال على المسار الزمني لجزيء واحد في الشكل 7 أ.أظهر تحليل FCCS / FCS (الارتباط المتبادل، CC والارتباط الذاتي، AC) أن المجاميع التي تحتوي على αS وtau كانت وفيرة في العينات (انظر منحنى CC في الشكل 7 ب، اللوحة اليسرى)، ونشأ فائض من البروتين الأحادي المتبقي ك نتيجة لعملية التخفيف (انظر منحنيات التيار المتردد في الشكل 7ب، اللوحة اليسرى).لم تظهر تجارب التحكم التي تم إجراؤها في ظل نفس ظروف المحلول باستخدام عينات تحتوي على بروتينات أحادية فقط أي منحنيات CC، وتتناسب منحنيات التيار المتردد جيدًا مع نموذج الانتشار أحادي المكون (المعادل 4)، حيث تمتلك البروتينات المونومرية معاملات الانتشار المتوقعة (الشكل 7 ب) )، اللوحة اليمنى).يبلغ معامل انتشار الجسيمات المجمعة أقل من 1 ميكرومتر2/ثانية، بينما يبلغ معامل انتشار البروتينات المونومرية حوالي 1 ميكرومتر2/ثانية.50-100 ميكرومتر/ثانية؛تتشابه القيم مع القيم المنشورة مسبقًا للألياف الأميلويد αS الصوتية و αS الأحادي بشكل منفصل في ظل ظروف حل مماثلة .عندما قمنا بتحليل الركام باستخدام تحليل انفجار TCCD (الشكل 7 ج، اللوحة العلوية)، وجدنا أنه في كل ركام معزول (αS/Tau heteroaggregate)، حوالي 60% من الركام المكتشف يحتوي على كل من αS وtau، حوالي 30% يحتوي فقط على تاو، حوالي 10% αS فقط.أظهر تحليل العناصر الكيميائية المتغايرة αS/Tau أن معظم المجاميع غير المتجانسة تم إثراءها في تاو (قياس العناصر المتفاعلة أقل من 0.5، متوسط ​​عدد جزيئات تاو لكل إجمالي هو 4 مرات أكثر من جزيئات αS)، وهو ما يتوافق مع عملنا الذي لوحظ في FLIM في الموقع التجارب..أظهر تحليل FRET أن هذه المجاميع تحتوي على كلا البروتينين، على الرغم من أن قيم FRET الفعلية في هذه الحالة ليست ذات أهمية كبيرة، حيث أن توزيع الفلوروفورات في كل مجاميع كان عشوائيًا بسبب وجود فائض من البروتين غير المسمى المستخدم في التجربة.ومن المثير للاهتمام ، عندما أجرينا نفس التحليل باستخدام متغير Tau الناقص في تجميع الأميلويد الناضج 45،46 (انظر الشكل التكميلي 11 أ ، ب) ، لاحظنا أنه على الرغم من أن التجميع الكهروستاتيكي αS كان هو نفسه (الشكل التكميلي 11 ج ، د) ، تم تقليل القدرة على تكوين المجاميع داخل coacervate بشكل كبير واكتشف FLIM عدة نقاط في التجارب الموقعية، ولوحظت منحنيات الارتباط المتبادل الضعيفة للعينات الإجمالية المعزولة.ومع ذلك، بالنسبة لعدد صغير من المجاميع المكتشفة (عُشر Tau441 فقط)، لاحظنا أنه تم إثراء كل مجاميع في αS مقارنة بمتغير Tau هذا، مع ما يقرب من 50% من المجاميع المكتشفة التي تحتوي على جزيئات αS فقط، وكان αS غير متجانس بشكل زائد .المجاميع (انظر الشكل التكميلي 11 هـ) ، على عكس المجاميع غير المتجانسة الناتجة عن Tau441 (الشكل 6f).أظهرت نتائج هذه التجارب أنه على الرغم من أن αS نفسه قادر على التراكم مع تاو داخل التحمض، إلا أن نواة تاو تكون أكثر ملاءمة في ظل هذه الظروف، وتكون المجاميع الشبيهة بالأميلويد الناتجة قادرة على العمل كشكل من أشكال αS وتاو.ومع ذلك، بمجرد تشكيل نواة غنية بالتاو، يتم تفضيل التفاعلات غير المتجانسة بين αS وتاو في المجاميع على التفاعلات المتماثلة بين جزيئات تاو؛نلاحظ أيضًا شبكات البروتين في αS / tau السائل.
آثار زمنية مضان تمثيلية لجزيئات مفردة من المجاميع المعزولة المتكونة في αS / Tau441 الكهروستاتيكي.وقد لوحظت رشقات نارية تقابل مجاميع αS/Tau441 (رشقات فوق العتبة المشار إليها) في ثلاث قنوات كشف (انبعاث AF488 وAtto647N بعد الإثارة المباشرة، الخطوط الزرقاء والحمراء، انبعاث Atto647N بعد الإثارة غير المباشرة)، FRET، الخط البنفسجي).ب تحليل FCS / FCCS لعينة من مجاميع αS / Tau441 المعزولة التي تم الحصول عليها من LLPS (اللوحة اليسرى).تظهر منحنيات الارتباط الذاتي (AC) لـ AF488 وAtto647N باللون الأزرق والأحمر، على التوالي، وتظهر منحنيات الارتباط المتبادل (CC) المرتبطة بالمجاميع التي تحتوي على كلا الأصباغ باللون الأرجواني.تعكس منحنيات التيار المتردد وجود أنواع البروتين الأحادية والمجمعة، في حين تظهر منحنيات CC فقط انتشار المجاميع ذات العلامات المزدوجة.نفس التحليل، ولكن في ظل نفس ظروف الحل كما هو الحال في البقع المعزولة، تظهر العينات التي تحتوي فقط على αS وTau441 الأحادي كعناصر تحكم في اللوحة اليمنى.ج تحليل فلاش الإسفار للجزيئات المفردة من المجاميع المعزولة المتكونة في αS / Tau441 الكهروستاتيكية.يتم رسم المعلومات الخاصة بكل مجموعة تم العثور عليها في أربعة تكرارات مختلفة (N = 152) مقابل قياس العناصر المتفاعلة، وقيم S، وكفاءة FRET (اللوحة العلوية، وشريط الألوان يعكس الحدوث).يمكن التمييز بين ثلاثة أنواع من المجاميع: - مجاميع αS فقط مع S~1 وFRET~0، مجاميع Tau فقط مع S~0 وFRET~1، ومجاميع Tau/αS غير المتجانسة مع تقديرات S وFRET المتوسطة للمبلغ يتم عرض كلا البروتينات المميزة المكتشفة في كل مجموعة غير متجانسة (N = 100) في اللوحة السفلية (يعكس مقياس اللون حدوثها).يتم توفير البيانات الأولية في شكل ملفات بيانات أولية.
تم الإبلاغ عن أن نضوج أو شيخوخة مكثفات البروتين السائل إلى هياكل تشبه الهلام أو الهياكل الصلبة بمرور الوقت متورط في العديد من الوظائف الفسيولوجية للمكثفات 47 وكذلك في المرض، كعملية غير طبيعية تسبق تراكم الأميلويد 7، 48، 49. هنا ندرس فصل المرحلة والسلوك بالتفصيل.LSPT αS في وجود تعددات عشوائية في بيئة خاضعة للرقابة بتركيزات ميكرومولار منخفضة وظروف ذات صلة من الناحية الفسيولوجية (لاحظ أن التركيز الفسيولوجي المحسوب لـ αS هو> 1 ميكرومتر50)، بعد السلوك النموذجي المدفوع بالديناميكا الحرارية لـ LPS.لقد وجدنا أن αS، الذي يحتوي على منطقة C-طرفية مشحونة سالبًا للغاية عند درجة الحموضة الفسيولوجية، قادر على تكوين قطرات غنية بالبروتين في محلول مائي عبر LLPS في وجود الببتيدات المضطربة الموجبة للغاية مثل pLK أو Tau من خلال عملية الكهرباء الساكنة. التكثيف المعقد في وجود الجزيئات الكبيرة التجميعية.قد يكون لهذه العملية تأثيرات ذات صلة في البيئة الخلوية حيث يواجه αS جزيئات متعددة الجزيئات مرتبطة بتجمعها المرتبط بالمرض سواء في المختبر أو في الجسم الحي 51،52،53،54.
في العديد من الدراسات، تعتبر ديناميكيات البروتين داخل القطرات أحد العوامل الرئيسية التي تحدد عملية النضج .في حالة αS الكهروستاتيكية التي تتفاقم مع التعددات، يبدو أن عملية النضج تعتمد على قوة التفاعلات مع التعددات، والتكافؤ، وتعدد هذه التفاعلات.تشير نظرية التوازن إلى أن مشهد التوازن بين حالتين سائلتين سيكون وجود قطرة كبيرة غنية بالبوليمرات الحيوية التي تحرك LLPS57،58.يمكن تحقيق نمو القطرات عن طريق نضوج أوستوالد أو الاندماج أو استهلاك المونومر الحر في المرحلة المشتتة .بالنسبة لـ αS وTau441 أو ΔNt-Tau أو pLK، تم تركيز معظم البروتين في المكثفات في ظل الظروف المستخدمة في هذه الدراسة.ومع ذلك، في حين أن قطيرات تاو كاملة الحجم تتجمع بسرعة عند ترطيب السطح، كان اندماج القطرات وترطيبها صعبًا بالنسبة لـ ΔNt-Tau وpLK، مما يشير إلى الفقدان السريع لخصائص السائل في هذين النظامين.وفقًا لتحليل FLIM-FRET، أظهرت قطرات pLK وΔNt-Tau القديمة درجة مماثلة من تجميع البروتين (عمر مضان مماثل) مثل القطرات الأصلية، مما يشير إلى الاحتفاظ بشبكة البروتين الأصلية، وإن كانت أكثر صلابة.
نقوم بترشيد نتائجنا التجريبية في النموذج التالي (الشكل 8).غالبًا ما تكون القطرات المتكونة مؤقتًا في البداية عبارة عن شبكات بروتينية بدون تعويض إلكتروستاتيكي، وبالتالي هناك مناطق من عدم توازن الشحنات، خاصة في واجهة القطرة، مما يؤدي إلى قطرات ذات إمكانات سطحية إلكتروستاتية عالية.للتعويض عن الشحنة (ظاهرة يشار إليها عادةً باسم استنفاد التكافؤ) وتقليل إمكانات سطح القطرات، يمكن أن تشتمل القطرات على بولي ببتيدات جديدة من الطور المخفف، وإعادة تنظيم شبكات البروتين لتحسين تفاعلات الشحنة والشحن، والتفاعل مع القطرات الأخرى.مع الأسطح (ترطيب).يبدو أن قطرات αS/pLK، نظرًا لشبكة البروتين الأبسط الخاصة بها (فقط التفاعلات غير المتجانسة بين αS وpLK) والألفة الأكبر لتفاعلات البروتين والبروتين، قادرة على موازنة شحنة المكثفات بسرعة أكبر؛في الواقع، لاحظنا حركية البروتين بشكل أسرع في αS/pLK التي تم تشكيلها في البداية مقارنة بـ αS/Tau.بعد استنفاد التكافؤ، تصبح التفاعلات أقل سريعة الزوال وتفقد القطرات خصائصها السائلة وتتحول إلى قطرات تشبه الهلام وغير قابلة للاشتعال مع إمكانات سطحية إلكتروستاتيكية منخفضة (وبالتالي غير قادرة على تبليل السطح).في المقابل، تكون قطرات αS/Tau أقل كفاءة في تحسين توازن شحنة القطرات بسبب شبكات البروتين الأكثر تعقيدًا (مع كل من التفاعلات المتماثلة وغير المتجانسة) والطبيعة الأضعف لتفاعلات البروتين.وينتج عن ذلك قطيرات تحتفظ بسلوكها السائل لفترات طويلة من الزمن وتُظهر إمكانات سطحية إلكتروستاتيكية عالية تميل إلى التقليل إلى الحد الأدنى عن طريق الاندماج والنمو (وبالتالي تقليل مساحة السطح / نسبة حجم القطرات) وعن طريق ترطيب الكيمياء السطحية المحبة للماء.يؤدي هذا إلى إنشاء مكتبات بروتينية مركزة كبيرة تحتفظ بخصائص السوائل حيث تظل التفاعلات عابرة للغاية بسبب البحث المستمر عن تحسين الشحن في شبكة البروتين.ومن المثير للاهتمام، أن أشكال Tau المقطوعة نهائيًا، بما في ذلك بعض الأشكال الإسوية التي تحدث بشكل طبيعي، تظهر سلوكًا متوسطًا، مع بعض الشيخوخة مع αS إلى قطرات طويلة العمر تشبه الهلام، بينما يتحول البعض الآخر إلى مكثفات سائلة كبيرة.تتوافق هذه الازدواجية في نضوج coacervates الكهروستاتيكية αS مع الدراسات النظرية والتجريبية الحديثة لـ LLPS التي حددت وجود علاقة بين استنفاد التكافؤ والنخل الكهروستاتيكي في المكثفات كمفتاح للتحكم في حجم المكثفات وخصائص السوائل.آلية 58.61.
يُظهر هذا المخطط مسار تجميع الأميلويد المفترض لـ αS وTau441 عبر LLPS وLSPT.مع وجود مناطق إضافية غنية بالأنيونات (الحمراء) وغنية بالكاتيونات (الزرقاء)، فإن αS وtau الكهروستاتيكية ذات التكافؤ المُرضي لها طاقة سطحية أقل وبالتالي اندماج أقل، مما يؤدي إلى شيخوخة القطرات السريعة.يتم تحقيق حالة هلامية مستقرة غير متكتلة..يعد هذا الوضع مناسبًا جدًا في حالة نظام αS/pLK نظرًا لتقاربه العالي وشبكة تفاعل زوج البروتين الأبسط، مما يسمح بانتقال سريع يشبه الهلام.على العكس من ذلك، فإن القطرات ذات التكافؤ غير المُرضي، وبالتالي المناطق المشحونة بالبروتين المتاحة للتفاعل، تجعل من السهل على المترابط أن يدمج ويبلل السطح المحب للماء من أجل تقليل طاقته السطحية العالية.يُفضل هذا الموقف بالنسبة إلى αS/Tau441 coacervates، التي لها شبكة معقدة متعددة التكافؤ تتكون من تفاعلات Tau-Tau وαS-Tau ضعيفة.وفي المقابل، ستحتفظ الكوسرفات الأكبر بخصائصها الشبيهة بالسوائل بسهولة أكبر، مما يسمح بحدوث تفاعلات أخرى بين البروتين والبروتين.في نهاية المطاف، تتشكل مجاميع الأميلويد غير المتجانسة التي تحتوي على كل من αS وtau داخل السائل المترابط، والتي قد تكون مرتبطة بتلك الموجودة في الأجسام المتضمنة، والتي تعد من السمات المميزة للأمراض التنكسية العصبية.
تعتبر الهياكل الكبيرة الشبيهة بالسوائل التي تتشكل أثناء نضوج αS/Tau441 مع بيئة بروتينية مزدحمة للغاية ولكنها ديناميكية، وبدرجة أقل، αS/ΔNt-Tau coacervates، بمثابة خزانات مثالية لنواة تجميع البروتين.لقد لاحظنا بالفعل تكوين مجاميع بروتينية صلبة في هذا النوع من البروتين المترابط، وغالبًا ما تحتوي على كل من αS وtau.لقد أظهرنا أن هذه المجاميع غير المتجانسة يتم تثبيتها عن طريق التفاعلات غير الكهروستاتيكية، وأنها قادرة على ربط أصباغ ThT الخاصة بالأميلويد بنفس طريقة ألياف الأميلويد النموذجية، ولديها بالفعل مقاومة مماثلة للتأثيرات المختلفة.تبين أن مجاميع αS/tau التي شكلتها LLPS لها خصائص تشبه الأميلويد.في الواقع، فإن المتغير الناضج من Tau الناقص في تجميع الأميلويد يضعف بشكل كبير في تكوين مجاميع αS غير المتجانسة داخل التحمض الكهروستاتيكي السائل.تمت ملاحظة تكوين مجاميع αS/Tau441 فقط داخل التحمضات، التي احتفظت بخصائص تشبه السائل، ولم تتم ملاحظة ذلك أبدًا، إذا لم تصل التواسيرفات/القطرات إلى حالة الجل.في الحالة الأخيرة، تمنع زيادة قوة التفاعلات الكهروستاتيكية، ونتيجة لذلك، صلابة شبكة البروتين عمليات إعادة الترتيب المطابقة الضرورية للبروتينات لإنشاء تفاعلات بروتينية جديدة ضرورية لنواة الأميلويد.ومع ذلك، يمكن تحقيق ذلك في مواد متماسكة أكثر مرونة وشبيهة بالسائل، والتي بدورها من المرجح أن تظل سائلة مع زيادة حجمها.
إن حقيقة أن تكوين المجاميع داخل الطور المكثف هو الأفضل في مكثفات αS/Tau الكبيرة مقارنة بالقطرات الصغيرة التي تتجلى بسرعة، يسلط الضوء على أهمية تحديد العوامل التي تتحكم في اندماج القطرات.وبالتالي، ليس هناك ميل لفصل الطور فحسب، بل يجب التحكم في حجم المكثفات من أجل الأداء السليم وكذلك الوقاية من الأمراض.تسلط نتائجنا الضوء أيضًا على أهمية التوازن بين LLPS وLSPT لنظام αS/Tau.في حين أن تكوين القطرات قد يحمي من تراكم الأميلويد عن طريق تقليل كمية مونومرات البروتين المتاحة في ظل ظروف التشبع، كما تم اقتراحه في أنظمة أخرى، فإن اندماج القطرات عند مستويات قطرات عالية قد يؤدي إلى تجميع البروتين الداخلي من خلال عمليات إعادة ترتيب توافقية بطيئة.شبكات البروتين..
بشكل عام، تؤكد بياناتنا بقوة على أهمية التكافؤ المتماسك والتفاعلات المرضية/غير المرضية في شبكات الإسقاط في سياق LSPT.على وجه الخصوص، نظهر أن مكثفات αS/Tau441 كاملة الطول قادرة على الاندماج والنواة بكفاءة لتكوين مجاميع متغايرة تشبه الأميلويد والتي تشمل كلا البروتينين وتقترح آلية جزيئية بناءً على نتائجنا التجريبية.قد يكون التجميع المشترك لبروتينين في سائل αS/Tau الذي أبلغنا عنه هنا مرتبطًا بالفعل بالتوطين المشترك لبروتينين في الشوائب، والتي تعد من السمات المميزة للمرض، وقد تساهم في فهم العلاقة بين LLPS و تراكم الأميلويد، مما يمهد الطريق للنازحين داخليًا المشحونين للغاية في التنكس العصبي.
تم التعبير عن WT-αS الأحادي وطفرات السيستين (Q24C-αS و N122C-αS) ومتغيرات ΔCt-αS (Δ101-140) في E. coli وتم تنقيتها كما هو موضح سابقًا.تم تضمين 5 مم DTT في جميع الخطوات في تنقية طفرات السيستين αS لمنع تكوين رابطة ثاني كبريتيد.isoform tau441 (البلازميد الذي تم الحصول عليه من Addgene #16316) ، متغير Δnt-tau (Δ1–150 ، تم الحصول عليه عن طريق استنساخ iva مع الاشعال ctttaagaagaGAGATATATGATCGCCACACCGCGG ، catatgtatcctctctctcttcttttaaAagtaaAGTAAAC) و aggtcAcgcgcg. كانت الثقافات E. القولونية نمت إلى OD600 = 0.6–0.7 عند 37 درجة مئوية و180 دورة في الدقيقة، وتم تحفيز التعبير باستخدام IPTG لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية.حصاد الخلايا عند 11500 x ج لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية ويغسل بمحلول ملحي يحتوي على 150 ملي مول كلوريد الصوديوم.إعادة تعليق بيليه في العازلة تحلل (20 مل لكل 1 لتر رطل: MES 20 ملم، ودرجة الحموضة 6.8، كلوريد الصوديوم 500 ملم، EDTA 1 ملم، MgCl2 0.2 ملم، DTT 5 ملم، PMSF 1 ملم، البنزاميدين 50 ميكرومتر، كوببتين 100 ميكرومتر).تم تنفيذ خطوة الصوتنة على الجليد بسعة 80% لمدة 10 نبضات (1 دقيقة تشغيل، 1 دقيقة إيقاف).لا تتجاوز 60 مل في الموجات فوق الصوتية الواحدة.تم تسخين محلولات الإشريكية القولونية عند 95 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة، ثم تبريدها على الجليد وطردها مركزيًا عند 127000 × جم لمدة 40 دقيقة.تم تطبيق المادة الطافية الموضحة على غشاء 3.5 كيلو دالتون (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific، المملكة المتحدة) وتم غسيلها مقابل 4 لتر من محلول غسيل الكلى (20 ملي مولار MES، درجة الحموضة 6.8، كلوريد الصوديوم 50 ملم، EDTA 1 ملم، MgCl2 2 ملم، DTT 2 ملم ، PMSF 0.1 مم) لمدة 10 ساعات.تمت معايرة عمود تبادل الكاتيون 5 مل (HiTrap SPFF، Cytiva، MA، USA) مع محلول موازنة (20 مم MES، درجة الحموضة 6.8، 50 مم كلوريد الصوديوم، 1 مم EDTA، 2 مم MgCl2، 2 مم DTT، 0.1 مم PMSF).تم ترشيح محلول تاو من خلال مرشح PVDF 0.22 ميكرومتر وحقنه في العمود بمعدل تدفق 1 مل / دقيقة.تم إجراء الشطف تدريجيًا، وتم شطف تاو باستخدام محلول شطف بنسبة 15-30٪ (20 مم MES، درجة الحموضة 6.8، 1 M NaCl، 1 مم EDTA، 2 مم MgCl2، 2 مم DTT، 0.1 مم PMSF).تم تحليل الكسور بواسطة SDS-PAGE، وتم تركيز أي كسور تحتوي على نطاق واحد مع الوزن الجزيئي المتوقع لـ tau باستخدام مرشح للطرد المركزي 10 كيلو دالتون واستبداله بمخزن مؤقت يحتوي على 10 ملي مولار HEPES، ودرجة الحموضة 7.4، وNaCl 500 ملم وDTT 2 ملم لـ كان تركيز البروتين النهائي 100 ميكرومتر.تم بعد ذلك تمرير محلول البروتين عبر مرشح PVDF بحجم 0.22 ميكرومتر، وتم تجميده بسرعة وتخزينه عند -80 درجة مئوية.تم تقديم البروتين K18 من قبل البروفيسور ألبرتو بوفي.كانت درجة نقاء المستحضر أكبر من 95% كما أكد ذلك SDS-PAGE وMALDI-TOF/TOF.تم تصنيف العديد من السيستين كيميائيًا باستخدام AlexaFluor488-maleimide (AF488، ThermoFisher Scientific، Waltham، MA، USA) أو TEMPOL-maleimide (Toronto Research Chemicals، تورونتو، كندا).تم تأكيدها عن طريق الامتصاص وMALDI-TOF/TOF.تمت تسمية Tau441 وΔNt-Tau وAggDef-Tau وK18 ببقايا السيستين الأصلية في الموضعين 191 و322 باستخدام Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH، Siegen، ألمانيا) باتباع نفس الإجراء.تم إنشاء صافي الشحنة لكل خرائط متبقية لـ αS و Tau441 باستخدام CIDER66.
تم إذابة poly-L-lysine الصلب (pLK DP 90-110 وفقًا للرنين المغناطيسي النووي من المورد، Alamanda Polymers Inc، Huntsville، Alabama، USA) في 10 ملي مولار HEPES، 100 ملي مول كلوريد الصوديوم، تركيز درجة الحموضة 7.4 إلى 10 ملم، عملية صوتنة لمدة 5 دقائق في حمام مائي بالموجات فوق الصوتية وتخزينها في -20 درجة مئوية.PEG-8، dextran-70، FITC-PEG-10 (Biochempeg، Watertown، MA، USA) و FITC-dextran-500 (Sigma -Aldrich، Sant Louis، MI، USA) قابلة للذوبان في الماء وموزعة على نطاق واسع في LLPS العازلة.غسيل الكلى يزيل الأملاح الملوثة.تم بعد ذلك ترشيحها من خلال مرشح حقنة بحجم مسام يبلغ 0.22 ميكرومتر، وتم حساب تركيزاتها باستخدام مقياس الانكسار (ميتلر توليدو، كولومبوس، أوهايو، الولايات المتحدة الأمريكية).تم تحضير عينات LLPS في درجة حرارة الغرفة بالترتيب التالي: تم خلط المخزن المؤقت والقذف و 1 ملم تريس (2-كربوكسي إيثيل) فوسفين (TCEP، Carbosynth، Compton، UK)، 1 ملم 2،2،2،2- (إيثان-) 1، 2-ثنائي النيتريل) حمض رباعي الأسيتيك (EDTA، كربوكسينث) وخليط من مثبط الأنزيم البروتيني 1٪ (PMSF 100 مم، بنزيميد 1 مم، ليوبيبتين 5 ميكرومتر).ثم تتم إضافة αS والمتعددات المنصهرة (الخيارات pLK أو Tau).بالنسبة لتجارب السلاسل الزمنية ثيوفلافين-T (ThT، كاربوسينث، كومبتون، المملكة المتحدة)، استخدم إجمالي تركيز ThT ليكون نصف تركيز αS.قم بخلط العينات بلطف ولكن بدقة للتأكد من أنها متجانسة.يختلف تركيز كل مكون من تجربة إلى أخرى، كما هو موضح في قسم النتائج.تم استخدام الأزيد بتركيز 0.02% (وزن/حجم) كلما زادت مدة التجربة عن 4 ساعات.بالنسبة لجميع التحليلات باستخدام عينات LLPS، اسمح للخليط بالتوازن لمدة 5 دقائق قبل التحليل.لتحليل تشتت الضوء، تم تحميل 150 ميكرولتر من العينات على ألواح ميكروية غير ملزمة مكونة من 96 بئرًا (μClear®، أسود، F-Bottom / Chimney Well، Greiner bio-one، Kremsmünster، النمسا) ومغطاة بفيلم لاصق.تمت مراقبة LLPs عن طريق قياس الامتصاصية عند 350 نانومتر في مركز المحلول في قارئ لوحة CLARIOstar (BMG Labtech، Ortenberg، ألمانيا).أجريت التجارب في ثلاث نسخ عند درجة حرارة 25 درجة مئوية، وتم حساب الأخطاء على أنها الانحراف المعياري عن المتوسط.تم قياس كمية المرحلة المخففة بواسطة عينة الطرد المركزي وتحليل هلام SDS-PAGE، وتم قياس كمية جزء αS في المراحل المخففة والمركزة في حلول LLPS المختلفة.تم تحضير عينة 100 ميكرولتر من LLPS تحتوي على 1 ميكرومتر AF488 المسمى αS عن طريق خلط شامل يليه الطرد المركزي عند 9600 × جم لمدة 30 دقيقة، وبعد ذلك كان الراسب مرئيًا عادةً.تم استخدام أعلى 50 ميكرولتر من طاف لتقدير كمية البروتين باستخدام هلام SDS-PAGE.تم مسح المواد الهلامية باستخدام مرشحات AF488 باستخدام نظام تصوير هلام ChemiDoc (Bio-Rad Laboratories، Hercules، CA، USA) أو ملطخة بصبغة Coomassie وتصور باستخدام المرشحات المناسبة.تم تحليل النطاقات الناتجة باستخدام ImageJ الإصدار 1.53i (المعاهد الوطنية للصحة، الولايات المتحدة الأمريكية).تم إجراء التجارب في نسختين في تجربتين مختلفتين لهما نتائج مماثلة.
عادةً، تم تطبيق 150 ميكرولتر من العينات على لوحات ميكروية غير ملزمة مكونة من 96 بئرًا وتم تصويرها في درجة حرارة الغرفة باستخدام مجهر مقلوب Leica DMI6000B (Leica Microsystems، Wetzlar، ألمانيا).بالنسبة للتجارب الموضعية، تم أيضًا استخدام ألواح تكوين الأوعية الدموية μ-Slide (Ibidi GmbH، Gräfelfing، ألمانيا) أو ألواح البوليسترين الدقيقة ذات 96 بئرًا (Corning Costar Corp.، Acton، Massachusetts).تم استخدام مصابيح الهالوجين أو معدن الزئبق EL6000 كمصادر للإضاءة (لتصوير BF/DIC وWF، على التوالي).بالنسبة للفحص المجهري WF، تم استخدام هدف هوائي تكبير 40x (Leica Microsystems، ألمانيا) لتركيز الضوء على العينة وجمعها.بالنسبة للعينات التي تحمل علامة AF488 وThT، قم بتصفية الإثارة والانبعاث باستخدام مجموعات مرشح GFP القياسية، ومرشحات الإثارة وممر نطاق الانبعاثات، على التوالي، 460-500 نانومتر و512-542 مرشحات ممر الموجة، ومرآة مزدوجة اللون 495 نانومتر.بالنسبة للعينات التي تحمل علامة Atto647N، تم استخدام مجموعة قياسية من مرشحات Cy5 مع مرشحات الإثارة وممر نطاق الانبعاث 628-40 نانومتر و692-40 نانومتر، على التوالي، ومرآة مزدوجة اللون 660 نانومتر.بالنسبة للفحص المجهري BF وDIC، استخدم نفس هدف جمع الضوء المنعكس.تم تسجيل الضوء المجمع على كاميرا Leica DFC7000 CCD (Leica Microsystems، ألمانيا).كان وقت التعرض 50 مللي ثانية للتصوير المجهري BF وDIC و20-100 مللي ثانية للتصوير المجهري WF.للمقارنة، كان وقت التعرض لجميع التجارب مع تى اتش تى 100 مللي ثانية.تم إجراء تجارب الفاصل الزمني لتصور اندماج القطرات، مع جمع الصور كل 100 مللي ثانية لعدة دقائق.تم استخدام ImageJ (NIH، الولايات المتحدة الأمريكية) لتحليل الصور.وأجريت التجارب في ثلاث نسخ مع نتائج مماثلة.
بالنسبة لتجارب التوطين المشترك، وإعادة الإعمار ثلاثية الأبعاد وFRAP، تم الحصول على الصور باستخدام مجهر متحد البؤر مقلوب Zeiss LSM 880 باستخدام الإصدار الأزرق ZEN 2 (Carl Zeiss AG، Oberkochen، ألمانيا).تم تطبيق عينات من 50 ميكرولتر على أطباق بيتري لتولد الأوعية الدموية (Ibidi GmbH، Gröfelfing، ألمانيا)، وتم معالجتها ببوليمر محب للماء (ibiTreat) وتم تركيبها في هدف غمر بالزيت 63 × (Plan-Apochromat 63×/NA 1.4 Oil) على مدينة دبي للإنترنت).تم الحصول على الصور باستخدام خطوط ليزر الأرجون 458 نانومتر، و488 نانومتر، و633 نانومتر بدقة 0.26 ميكرومتر/بكسل ووقت تعريض قدره 8 ميكروثانية/بكسل لنوافذ الإثارة واكتشاف الانبعاثات التي تتراوح بين 470-600 نانومتر، و493-628 نانومتر، وتم استخدام 638-755 نانومتر لتصور ThT وAF488 وAtto647N، على التوالي.بالنسبة لتجارب FRAP، تم تسجيل التصوير الفوتوغرافي بفاصل زمني لكل عينة بمعدل إطار واحد في الثانية.أجريت التجارب في ثلاث نسخ في درجة حرارة الغرفة وكانت النتائج مماثلة.تم تحليل جميع الصور باستخدام برنامج Zen 2 blue edition (Carl Zeiss AG، Oberkochen، Germany).تمت تسوية منحنيات FRAP وتخطيطها وتركيبها وفقًا لبيانات الكثافة/الوقت المستخرجة من الصور باستخدام Zen 2 باستخدام OriginPro 9.1.تم تركيب منحنيات الاسترداد على نموذج أحادي الأسي لحساب الانتشار الجزيئي مع مصطلح أسي إضافي لحساب تأثير تبييض الاستحواذ.قمنا بعد ذلك بحساب D باستخدام نصف قطر التبييض الاسمي ونصف عمر الاسترداد المحدد مسبقًا كما في معادلة Kang et al.5 35 معروض.
تم تصنيع متغيرات السيستين المفردة لـ αS مع 4-هيدروكسي-2،2،6،6-رباعي ميثيل بيبيريدين-N-أوكسيل (TEMPOL) في المواضع 24 (TEMPOL-24-αS) و122 (TEMPOL-122-αS)، على التوالى.Spin Labeling بالنسبة لتجارب EPR، تم ضبط تركيز αS عند 100 ميكرومتر وكان تركيز PEG 15% (وزن/حجم).بالنسبة لظروف التجميع المختلفة، كانت نسبة αS:pLK 1:10، في حين تم الحفاظ على نسب αS:ΔNt-Tau وαS:Tau441 عند 1:1.بالنسبة لتجارب المعايرة الملزمة في غياب الازدحام، تم الحفاظ على TEMPOL-122-αS عند 50 ميكرومتر وتمت معايرة التعددات بتركيزات متزايدة، وإعداد كل حالة على حدة.تم إجراء قياسات CW-EPR باستخدام مطياف النطاق Bruker ELEXSYS E580 X المجهز برنان Bruker ER4118 SPT-N1 الذي يعمل بتردد ميكروويف (SHF) يبلغ حوالي 9.7 جيجا هرتز.تم ضبط درجة الحرارة على 25 درجة مئوية ويتم التحكم فيها بواسطة ناظم البرد النيتروجين السائل.تم الحصول على الأطياف في ظل ظروف غير مشبعة بقدرة ميجاوات تبلغ 4 ميجاوات، وسعة تعديل قدرها 0.1 طن متري، وتردد تعديل قدره 100 كيلو هرتز.تم تطبيع الشدة الطيفية لتجنب الاختلافات في تركيزات الدوران بين العينات واحتمال تقليل الدوران بسبب التركيزات المتبقية لعوامل الاختزال في العينات التي تحتوي على Tau441 أو ΔNt-Tau (الموجود في محاليل البروتين الأصلية).تم الحصول على القيم المحددة لـ g نتيجة للنمذجة الطيفية EPR التي تم إجراؤها باستخدام برنامج Easyspin (الإصدار 6.0.0-dev.34) المطبق في Matlab®67.تم استخدام نماذج الخواص المكونة من مكون واحد أو مكونين لنمذجة البيانات.بعد تطبيع جميع الإشارات، تم حساب البقايا بطرح كل محاكاة من الطيف التجريبي المقابل.لتحليل المعايرة الملزمة، تم استخدام الكثافة النسبية للنطاق الثالث إلى النطاق الثاني من طيف EPR الطبيعي (IIII/III) لمراقبة ربط التعددات بـ αS.لتقدير ثابت التفكك (Kd)، تم تركيب المنحنى الناتج على نموذج تقريبي يفترض مواقع ربط متطابقة ومستقلة.
تم إجراء تجارب التحليل الطيفي للرنين المغناطيسي النووي باستخدام مطياف الرنين المغناطيسي النووي Bruker Neo 800 MHz (1H) المجهز بمسبار التبريد والتدرج Z.تم إجراء جميع التجارب باستخدام 130-207 ميكرومتر αS ومكافئات αS / ΔNt-Tau و pLK المقابلة في 10 ملي مولار HEPES و 100 ملي كلوريد الصوديوم و 10٪ D O ودرجة الحموضة 7.4 وتم إجراؤها عند 15 درجة مئوية.لمراقبة LPS بواسطة الرنين المغناطيسي النووي، تمت إضافة 10٪ PEG إلى العينات المختلطة مسبقًا.تُظهر مؤامرة اضطراب التحول الكيميائي (الشكل 1 ب) متوسط ​​التحولات الكيميائية 1H و15N.تم تعيين أطياف αS 2D1H-15N HSQC بناءً على مهمة سابقة (إدخال BMRB رقم 25227) وتم تأكيدها من خلال تسجيل وتحليل الأطياف ثلاثية الأبعاد لـ HNCA وHNCO وCBCAcoNH.تم حساب التحولات الكيميائية 13Cα و13Cβ في وجود ΔNt-Tau أو pLK لقياس التغيرات المحتملة في اتجاهات البنية الثانوية مقارنة بالتحولات الكيميائية αS في التشكل العشوائي النقي للملف 68 (الشكل التكميلي 5c).تم قياس معدلات R1ρ عن طريق تسجيل تجارب hsqctretf3gpsi (تم الحصول عليها من مكتبة Bruker) مع تأخيرات قدرها 8، 36، 76، 100، 156، 250، 400، و800 مللي ثانية، وتم تعديل الوظائف الأسية لتأخير شدة الذروة عند مختلف مرات لتحديد R1ρ وعدم اليقين التجريبي.
تم إجراء تجارب مجهرية مضان ثنائية اللون تم حلها بمرور الوقت على مجهر متحد البؤر مضان MT200 تجاريًا (PicoQuant ، برلين ، ألمانيا) مع جهاز عد الفوتون الفردي المرتبط بالوقت (TCSPC).يتم استخدام رأس الصمام الثنائي الليزري للإثارة النبضية المتداخلة (PIE)، ويمر الشعاع عبر دليل موجي أحادي الوضع ويتم ضبطه على طاقة ليزر تتراوح من 10 إلى 100 نيوتن واط لخطوط ليزر 481 نانومتر و637 نانومتر يتم قياسها بعد مرآة مزدوجة اللون.وهذا يضمن معدل عد الفوتون الأمثل، وتجنب آثار التعرج الفوتون، والتبييض الضوئي والتشبع.تم وضع ساترة أو ألواح تكوين الأوعية الدموية μ-Slide (Ibidi GmbH، Gräfelfing، ألمانيا) مباشرة في الماء المغمور فوق عدسة Super Apochromat 60x NA 1.2 مع طوق تصحيحي (Olympus Life Sciences، Waltham، الولايات المتحدة الأمريكية).تم استخدام مرآة مزدوجة اللون مقاس 488/640 نانومتر (سيمروك، ليك فورست، إلينوي، الولايات المتحدة الأمريكية) كمقسم شعاع رئيسي.يتم حجب الإشعاع غير المركز بواسطة ثقب يبلغ قطره 50 ميكرون، ثم يتم تقسيم الإشعاع المركز إلى مسارين للكشف بواسطة مقسم شعاع 50/50.تم استخدام مرشحات انبعاث Bandpass (Semrock، Lake Forest، IL، USA) 520/35 للصبغة الخضراء (AF488) و690/70 للصبغة الحمراء (Atto647N) أمام الكاشف.تم استخدام الثنائيات الانهيارية أحادية الفوتون (SPAD) (أجهزة الفوتون الصغيرة ، بولزانو ، إيطاليا) ككاشفات.تم إجراء جمع البيانات وتحليلها باستخدام برنامج SymphoTime64 المتوفر تجاريًا (PicoQuant GmbH، برلين، ألمانيا).
تم تطبيق خمسين ميكروليتر من عينات LLPS على آبار تكوين الأوعية الدموية μ-Slide (Ibidi GmbH، Gräfelfing، ألمانيا).تركز الصور الناتجة على 20 ميكرومتر فوق قاع البئر للحصول على مسافة عمل موضوعية مثالية للقطرات المعلقة وإلى ~ 1 ميكرومتر للطوافات والنقاط بدقة محورية لا تقل عن 0.25 ميكرومتر/بكسل ووقت تأخير قدره 400 ميكرومتر/بكسل.حدد البيانات عن طريق تطبيق عتبة كثافة استناداً إلى متوسط ​​كثافة إشارة الخلفية (PBG، يعني + 2σ) لكل قناة بحيث يتم تحديد قطرات البروتين السائل فقط، أو الطوافات، أو البقع، وتصفية أي أصل محتمل من المرحلة المشتتة.لتحليل عمر كل نوع (τ) لكل قناة (الأخضر، "g" لـ AF488 والأحمر، "r" لـ Atto647N)، اخترنا المناطق ذات الاهتمام (ROIs) التي تحتوي على قطرات أو أطواف أو بقع (الشكل التكميلي 1) ).(الشكل 8 ب) واشتقها عن طريق تركيب اضمحلال مدى الحياة (τD و τR و τP للقطرات أو الطوافات أو البقع، على التوالي، انظر الشكل التكميلي 8c) في كل قناة باستخدام تحليل ملائم للذيل ونموذج تسوس مكون من مكونين.المتوسط ​​τ من τ .تم استبعاد عائد الاستثمار الذي أنتج عددًا قليلاً جدًا من الفوتونات لملاءمة متعددة الأسي من التحليل.كان القطع المستخدم أقل من 104 فوتونات للطوافات والنقاط و103 فوتونات للقطرات.القطرات لها عتبة أقل لأنه من الصعب الحصول على منحنيات الاضمحلال بقيم كثافة أعلى، حيث أن القطرات في مجال الصورة عادة ما تكون أصغر وأقل عددًا.تم أيضًا تجاهل عائد الاستثمار الذي يحتوي على عدد فوتون أعلى من حد تراكم الفوتون (المضبوط على> 500 عدد/بكسل) للتحليل.قم بمطابقة منحنى تسوس الكثافة الذي تم الحصول عليه من المنطقة محل الاهتمام بكثافة تبلغ 90% من الحد الأقصى (قليلاً بعد الحد الأقصى لكثافة الاضمحلال) من بداية عمر الخدمة لضمان الحد الأدنى من تداخل IRF مع الحفاظ على نفس الشيء بالنسبة لجميع تسوس الكثافة إعدادات النافذة الزمنية النسبية تم تحليل 25 إلى 50 عائد استثمار للطوافات والبقع و15-25 عائد استثمار للقطرات، الصور المختارة من أكثر من 4 نسخ متماثلة مسجلة من 3 تجارب مستقلة على الأقل.تم استخدام اختبارات t ثنائية الذيل لتقييم الاختلافات الإحصائية بين الأنواع أو بين أنظمة coacervate.ولتحليل العمر (τ) بكسل تلو الآخر، تم حساب التوهين الإجمالي للعمر على المجال لكل قناة وتم إجراء تقريب لنموذج التوهين الأسي المكون من 2/3.تم بعد ذلك تركيب التوهين مدى الحياة لكل بكسل باستخدام قيم τ المحسوبة مسبقًا، مما أدى إلى الحصول على صورة ملائمة لـ FLIM ذات ألوان زائفة.كان نطاق عمر توافق الذيل هو نفسه في جميع الصور لنفس القناة، وكل انحطاط أنتج ما يكفي من الفوتونات لتوفير توافق موثوق.لتحليل الحنق، تم اختيار وحدات البكسل من خلال تطبيق عتبة كثافة أقل تبلغ 100 فوتون، والتي بلغ متوسطها إشارة خلفية (FBG) تبلغ 11 فوتونًا.تم تصحيح شدة التألق لكل قناة من خلال عوامل التصحيح المحددة تجريبيًا: 69 الحديث المتبادل الطيفي α كان 0.004، والإثارة المباشرة β كانت 0.0305، وكفاءة الكشف γ كانت 0.517.يتم بعد ذلك حساب كفاءة FRET على مستوى البكسل باستخدام المعادلة التالية:
حيث FDD هي شدة التألق الملحوظة في القناة المانحة (الخضراء)، وFDA هي شدة التألق الملحوظة في قناة المستقبل (الحمراء) تحت الإثارة غير المباشرة، وFAA هي شدة التألق الملحوظة في قناة المستقبل (الحمراء) تحت الإثارة المباشرة ( فطيرة).ولوحظت نبضات شدة الإسفار في القناة).
ضع 100 ميكرولتر من محاليل تفاعل LLPS التي تحتوي على 25 ميكرومتر من Tau441 المونوميري غير المسمى (مع أو بدون 25 ميكرومتر αS) في المخزن المؤقت LLPS (المكمل على النحو الوارد أعلاه) على لوحات ميكروية غير ملزمة ذات 96 بئرًا مع طلاء رقائق لاصقة وتم فحص تكوين القطرات بواسطة الفحص المجهري WF بعد التوازن.في غضون 10 دقيقة.وبعد 48 ساعة من الحضانة في درجة حرارة الغرفة، تم التأكد من وجود أطواف البروتين والبقع.ثم قم بإزالة السائل بعناية فوق الطوافات من الآبار، ثم قم بإضافة 50 لتر من المخزن المؤقت للتفكك (10 ملم HEPES، درجة الحموضة 7.4، 1 M NaCl، 1 ملم DTT) واحتضان لمدة 10 دقائق.يضمن تركيز الملح العالي أن LLPS لن يتكرر بسبب PEG المتبقي، وسيتم تفكيك تجميعات البروتين المحتملة التي تتكون فقط من خلال التفاعلات الكهروستاتيكية.تم بعد ذلك كشط قاع البئر بعناية باستخدام طرف ماصة دقيقة وتم نقل المحلول الناتج إلى بئر مراقبة فارغ.بعد حضانة العينات بـ 50 ميكرومتر ThT لمدة ساعة واحدة، تم فحص وجود البقع المعزولة بواسطة الفحص المجهري WF.إعداد ألياف ليفية αS صوتية عن طريق احتضان 300 ميكرولتر من محلول αS 70 ميكرومتر في برنامج تلفزيوني مع درجة الحموضة 7.4، أزيد الصوديوم 0.01٪ عند 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة على شاكر مداري لمدة 7 أيام.تم بعد ذلك طرد المحلول عند 9600 × جم لمدة 30 دقيقة، وتم إعادة تعليق الحبيبة في PBS pH 7.4 وصوتنة (1 دقيقة، دورة 50٪، سعة 80٪ في سونيكاتور Vibra-Cell VC130، Sonics، Newton، USA) عينات ليفية مع توزيع حجم موحد نسبيا من الألياف الصغيرة.
تم إجراء تحليل FCS / FCCS والكشف عن الصدفة ثنائية اللون (TCCD) على نفس المجهر الفلوري متحد البؤر الذي تم حله بالوقت MT200 (Pico-Quant، Berlin، Germany) المستخدم في تجارب الفحص المجهري FLIM-FRET باستخدام وضع PIE.تمت إضافة طاقة الليزر لهذه التجارب إلى 6.0 ميكرووات (481 نانومتر) و6.2 ميكرووات (637 نانومتر).تم اختيار مزيج قوى الليزر هذه لإنتاج سطوع مماثل لأزواج الفلوروفورات المستخدمة مع تحقيق معدلات العد المثالية وتجنب التبييض الضوئي والتشبع.تم إجراء كل من جمع البيانات وتحليلها باستخدام برنامج SymphoTime64 الإصدار 2.3 المتوفر تجاريًا (PicoQuant، Berlin، Germany).
يتم تخفيف عينات من مجاميع αS/Tau المعزولة التي تم الحصول عليها باستخدام LLPS في المخزن المؤقت للعزلة إلى التركيز الأحادي الجزيئي المناسب (عادةً التخفيف بنسبة 1:500، نظرًا لأن المجاميع موجودة بالفعل بتركيزات منخفضة عند عزلها عن عينات coacervate).تم تطبيق العينات مباشرة على الأغطية (كورنينج، الولايات المتحدة الأمريكية) المطلية مسبقًا بمحلول BSA بتركيز 1 مجم / مل.
بالنسبة لتحليل PIE-smFRET في القنوات الخضراء والحمراء، تم تطبيق عتبة كثافة أقل تبلغ 25 فوتونًا لتصفية الإشارات منخفضة الكثافة الناجمة عن الأحداث الأحادية (لاحظ أن عدد المونومرات يفوق عدد العينات المجمعة مقارنة بالمجاميع المعزولة).تم حساب هذه العتبة على أنها خمسة أضعاف متوسط ​​كثافة المونومير αS الذي تم الحصول عليه من تحليل عينات المونومر النقي من أجل تحديد المجاميع للتحليل على وجه التحديد.لقد مكنت دائرة محرك PIE، جنبًا إلى جنب مع الحصول على بيانات TSCPC، من تطبيق مرشح الترجيح مدى الحياة الذي يساعد على التخلص من الخلفية والتداخل الطيفي.تم تصحيح شدة التوهج المحددة باستخدام العتبات المذكورة أعلاه باستخدام إشارة الخلفية المتوسطة المحددة من الرسوم البيانية للحدث مقابل الكثافة/صندوق عينات المخزن المؤقت فقط.عادةً ما تشغل الاندفاعات المرتبطة بالمجاميع الكبيرة عدة صناديق متتالية في التتبع الزمني (تم ضبطها على 1 مللي ثانية).في هذه الحالات، تم اختيار صندوق ذو قوة قصوى.بالنسبة لـ FRET وتحليل العناصر المتكافئة، تم استخدام عامل جاما المحدد نظريًا γ (0.517).الحديث المتبادل الطيفي ومساهمات الإثارة المباشرة لا تذكر (يتم تحديدها تجريبياً) عند طاقة الليزر المثيرة المستخدمة.يتم حساب كفاءة وكيمياء العناصر الغذائية لـ FRET في الانفجار على النحو التالي.