310 10 * 1 مم مكون كيميائي للأنابيب الملفوفة من الفولاذ المقاوم للصدأ، مجالات N- الطرفية من spidroin تشكل الهلاميات المائية على أساس ألياف أميلويد وتوفر منصة لتثبيت البروتين.

شكرا لكم لزيارة Nature.com.أنت تستخدم إصدار متصفح مع دعم محدود لـ CSS.للحصول على أفضل تجربة، نوصي باستخدام متصفح محدث (أو تعطيل وضع التوافق في Internet Explorer).بالإضافة إلى ذلك، ولضمان الدعم المستمر، نعرض الموقع بدون أنماط وجافا سكريبت.
أشرطة التمرير تعرض ثلاث مقالات لكل شريحة.استخدم زري الرجوع والتالي للتنقل عبر الشرائح، أو أزرار التحكم في الشرائح الموجودة في النهاية للتنقل خلال كل شريحة.

تخصيص

310 موردي أنابيب ملفوفة من الفولاذ المقاوم للصدأ مقاس 10*1 مم

التركيب الكيميائي

الخواص الميكانيكية

تمتلك بروتينات حرير العنكبوت المؤتلف (بروتينات حرير العنكبوت) العديد من التطبيقات المحتملة في تطوير مواد حيوية جديدة، ولكن طبيعتها المتعددة الوسائط والمعرضة للتجميع تجعل من الصعب الحصول عليها وسهلة الاستخدام.نذكر هنا أن بروتينات السبيدروين المصغرة المؤتلفة، والأهم من ذلك، مجال N-terminal (NT) نفسه يشكل بسرعة هيدروجيلات شفافة ذاتية الدعم عند 37 درجة مئوية.تشكل بروتينات الاندماج التي تتكون من بروتين NT والبروتين الفلوري الأخضر أو ​​فسفوريلاز نوكليوزيد البيورين بروتينات اندماج كاملة الوظائف.الهلاميات المائية.تظهر نتائجنا أن بروتينات NT والانصهار المؤتلفة توفر عوائد عالية التعبير وتمنح الهلاميات المائية بخصائص جذابة مثل الشفافية والجيل دون تشابك والتثبيت المباشر للبروتينات النشطة بكثافة عالية.
تمتلك العناكب ما يصل إلى سبع مجموعات مختلفة من الغدد الحريرية، تنتج كل منها نوعًا معينًا من الحرير.تتكون جميع أنواع الحرير السبعة من بروتينات حرير العنكبوت (spidroins) التي يبلغ طولها حوالي 6000 بقايا وتحتوي على منطقة تكرار مركزية كبيرة محاطة بنطاقات طرفية كروية N وC (NT وCT) 1،2.أكثر أنواع الحرير التي تمت دراستها على نطاق واسع، الأمبولة الأولية، يتم إنتاجها بواسطة الغدة الأمبولة الأولية.في هذه الغدة، تقوم طبقة أحادية من الخلايا الظهارية بتوليف بروتينات السبيدروين وإفرازها في تجويف الغدة، حيث تكون موجودة في شكل قابل للذوبان (المنشطات) بتركيزات عالية للغاية (30-50٪ وزن / حجم) 3،4.تمت مناقشة تنظيم وتشكل بروتينات السبيدروين الأمبولية الرئيسية في الغدة، لكن معظم الأدلة التجريبية تشير إلى وجود تشكل حلزوني حلزوني و/أو عشوائي بشكل عام وهياكل مذيلية أو صفائحية.في حين أن المجالات المتكررة تنظم الخواص الميكانيكية لألياف الحرير، وتشكل بلورات نانوية ذات صفائح وهياكل غير متبلورة، فإن المجالات النهائية تنظم ألياف الحرير استجابة للظروف المتغيرة على طول غدة الحرير.من خلال التحكم في تكوين الحرير، 19. يتم الحفاظ على المجالات الطرفية تطوريًا وقد تكون وظيفتها مشتركة بين جميع بروتينات السبيدروين 2،20،21.أثناء المرور عبر الغدة، ينخفض ​​الرقم الهيدروجيني للسبيدروين من حوالي 7.6 إلى أقل من 5.716 ويزداد مع القص والتمدد بوساطة الحركة عبر القناة المتضيقة تدريجيًا.في المحلول، يعد CT ثنائيًا متوازيًا تأسيسيًا حلزونيًا α، ولكن استجابةً لانخفاض درجة الحموضة وقوى القص، تتكشف الأشعة المقطعية وتبديل الطبقات 16، 17، مما قد يؤدي إلى تحفيز طبقات β في المناطق المتكررة للتحويل 16. NT أحادية تحت الظروف التي تعكس الظروف في تجويف الغدة وتتوسط ذوبان السبيدروين، ولكن عند انخفاض الرقم الهيدروجيني، يؤدي تضخم عدد من السلاسل الجانبية لحمض الكربوكسيل إلى تقليص NT مع pKa يبلغ حوالي 6.5، وبالتالي تثبيت NT وتثبيت السبيدروين في كميات كبيرة. كميات.الشبكات16،18.وبالتالي، يلعب NT دورًا رئيسيًا في تكوين الخيوط، حيث يتغير من مونومر في الطلاء إلى ثنائي في الألياف .تظل NT شديدة الذوبان وحلزونية في ظل جميع الظروف التي تمت دراستها حتى الآن، 16، 18، 19، 20، 26، 27، 28، 29، والتي ألهمت تطويرها كملصق معزز للذوبان لإنتاج البروتينات غير المتجانسة.
بروتين حرير العنكبوت الصغير المؤتلف، الذي يتكون من NT واحد، ومنطقة تكرار قصيرة واحدة، وCT واحد، وعلامة His6 (His-NT2RepCT) للتنقية، قابل للذوبان في محلول مائي مثل بروتين حرير العنكبوت الأصلي ويحاكي الخصائص المهمة الأصلية لعنكبوت الحرير. .التغطية 25.31.يمكن نسج His-NT2RepCT إلى ألياف متواصلة باستخدام آلة المحاكاة الحيوية حيث يتم بثق طبقة قابلة للذوبان ذات درجة حموضة 8 في حمام مائي بدرجة حموضة 525،32،33،34،35.أدى تخمير المفاعل الحيوي لبكتيريا E. coli التي تعبر عن His-NT2RepCT والمعالجة اللاحقة اللاحقة إلى إنتاج > 14 جم/لتر بعد التنقية.يُعزى العائد المرتفع والقابلية العالية للذوبان والاستجابة الكافية لـ His-NT2RepCT للظروف الحمضية إلى NT23، 25، 34.
نحن هنا نورد تقريرًا عن التكوين السريع للهلاميات المائية الشفافة من بروتينات السبيدروين المؤتلفة، بما في ذلك NT وحده، عن طريق احتضان محلول البروتين عند 37 درجة مئوية.باستخدام مضان ثيوفلافين T (ThT)، ومطياف الأشعة تحت الحمراء لتحويل فورييه (FTIR)، ومطياف الرنين المغناطيسي النووي (NMR) والمجهر الإلكتروني النافذ (TEM)، وجدنا أن بروتينات NT وmicrospider تخضع للتحول الهيكلي إلى صفائح β وألياف تشبه الأميلويد. عندما تتشكل المواد الهلامية.بالإضافة إلى ذلك، تشكل بروتينات الاندماج من NT والبروتين الفلوري الأخضر (GFP) أو فسفوريلاز نيوكليوسيد البيورين (PNP) الهلاميات المائية مع شظايا اندماج كاملة الوظائف.إن التعبير عالي الإنتاجية في المضيفين غير المتجانسين، إلى جانب التكوين السريع للهلاميات المائية في ظل الظروف الفسيولوجية، يفتح إمكانية إنتاج الهلاميات المائية بتكلفة فعالة مع وظائف هندسية.
على عكس معظم بروتينات السبيدروين المؤتلفة المُبلغ عنها، فإن His-NT2RepCT مستقر في المخزن المؤقت Tris-HCl عند درجة الحموضة 8 ويمكن تركيزه حتى 500 مجم/مل دون هطول.لذلك، فوجئنا عندما وجدنا أن هذا البروتين يشكل بسرعة هيدروجيلات واضحة بصريًا ذاتية الدعم عند حضنها عند درجة حرارة 37 درجة مئوية (الشكل 1 ب-د).أظهرت دراسات أخرى أن تجلط His-NT2RepCT حدث على نطاق واسع من تركيزات البروتين (10-300 مجم / مل) وأن هذا التركيز كان مرتبطًا عكسًا بوقت التبلور (الشكل 1 ج والشكل التكميلي 1).لمعرفة أي أجزاء من His-NT2RepCT تتوسط في تكوين هيدروجيل، قمنا بعد ذلك بفحص كل مجال على حدة وفي مجموعات مختلفة باستخدام اختبار انعكاس القارورة (الشكل 1 أ، ب).جميع الكسور التي تم اختبارها من المواد الهلامية المكونة من السبيدروين المؤتلف (بتركيز بروتين قدره 300 مجم / مل) في أقل من ساعة واحدة، باستثناء 2Rep المترسب (الشكل 1 ب).يشير هذا إلى أن NT وCT وحدهما، أو مجتمعين، أو مرتبطين بالتكرارات، يمكن أن يتماسكا عند 37 درجة مئوية وأن علامة His6 لا تؤثر على هذه العملية إلى حد كبير.بالنظر إلى الفكرة الشائعة القائلة بأن NT هو بروتين عالي الذوبان ومستقر، وأن التقارير السابقة عن الهلاميات المائية السبيدروين المؤتلفة قد عزت تأثيرات الجيل إلى التغيرات التوافقية في مناطق التكرار و/أو الأشعة المقطعية، يمكن أن يفعل ذلك NT نفسه.كان اكتشاف الجيلاتين غير متوقع.الجدول التكميلي 1) 37، 38، 39. ومن اللافت للنظر أن NT تبلور بالفعل خلال 10 دقائق بتركيز ≥ 300 مجم / مل (الشكل 1 ج).أظهرت تجارب انقلاب القنينة بتركيزات مختلفة من NT أنه عند > 50 ملغم/مل، تبلور محلول NT بشكل أسرع من His-NT2RepCT عند التركيز المقابل (وزن/حجم، الشكل 1ج).
تمثيل تخطيطي لمختلف بنيات السبيدروين التي تمت دراستها في هذا العمل.ب تم التحقق من وقت الجل عند 37 درجة مئوية لمختلف بروتينات السبيدروين المؤتلفة (300 مجم / مل) عن طريق قلب القارورة.هلام CT على الفور دون حضانة (<300 ملغم/مل)، رواسب 2Rep (300 ملغم/مل، مقياس 5 مم).ج وقت جل His-NT2RepCT و NT بتركيزات البروتين المشار إليها عند 37 درجة مئوية.د صور فوتوغرافية للجيلات المائية His-NT2RepCT و NT مع العنكبوت والحرف "NT" المطبوع أسفله، على التوالي (كلاهما 200 مجم / مل، شريط مقياس 5 مم).
الهلاميات المائية التي تتكون من بروتينات سبيدروين المؤتلفة المختلفة لها ألوان مختلفة قليلاً، وتُظهر مراقبة العين المجردة درجات متفاوتة من الشفافية (الشكل 1 ب).المواد الهلامية NT واضحة بشكل استثنائي بينما تصبح المواد الهلامية الأخرى معتمة.يمكن إزالة المواد الهلامية His-NT2RepCT وNT المصبوبة في أنابيب أسطوانية من القالب سليمًا (الشكل 1 د).
لاختبار ما إذا كان جل طلاء حرير العنكبوت الطبيعي في ظل الظروف التي وُجد الآن أنه يتسبب في تكوّن بروتينات السبيدروين المؤتلفة، تم جمع الطلاءات من غدة الأمبولة الكبيرة لعنكبوت الجسر السويدي (Larinioides sclopetarius).تم تخزين الطلاءات في محلول Tris-HCl سعة 20 ملي مولار عند 50 مجم / مل (استنادًا إلى الوزن الجاف المقاس) ، ولكن لم يلاحظ أي جيل أثناء الحضانة لمدة 21 يومًا عند 37 درجة مئوية (الشكل التكميلي 2 أ).
لقياس هذه المواد الهلامية، يمكن استخدام القياسات الريولوجية لدراسة عملية الجيل وتحديد الخواص الميكانيكية الشاملة.على وجه الخصوص، مراقبة معامل التخزين (المرونة) في درجات حرارة مرتفعة يمكن أن توفر معلومات عن درجة حرارة التبلور وكذلك خصائص اللزوجة المرنة للطلاء.أظهرت تجارب ارتفاع درجة الحرارة (باستخدام 1 درجة مئوية/دقيقة عند 25-45 درجة مئوية، بناءً على دراسات سابقة باستخدام محاليل مخزون الحرير الطبيعي) أن وحدات تخزين محاليل His-NT2RepCT وNT زادت مع زيادة درجة الحرارة.تمت زيادته (الشكل 2 والشكل التكميلي 3).والجدير بالذكر أن وحدة NT بدأت تنمو عند درجة حرارة أقل مقارنة بـ His-NT2RepCT، بما يتوافق مع وقت الجل الأسرع الذي لوحظ عندما تم حضانة NT مباشرة مع His-NT2RepCT عند 37 درجة مئوية (الشكل 1).بعد انخفاض لاحق في درجة الحرارة، لم يعد معامل التخزين إلى قيم أقل وظل أعلى من معامل الخسارة (انظر الشكل التكميلي 3)، مما يشير إلى وجود جيل مستقر لا رجعة فيه حرارياً.بعد التبلور، تراوح المعامل المرن النهائي من 15 إلى 330 كيلو باسكال للجيلات المائية His-NT2RepCT بتركيز 100-500 مجم/مل، وتراوح المعامل المرن النهائي للهيدروجيلات NT (100-500 مجم/مل) من 2 إلى 1400 كيلو باسكال (الشكل 2 وبيانات المنحدر الكاملة) انظر الشكل التكميلي 3).
تغير في درجة الحرارة أثناء قياسات His-NT2RepCT (300 مجم / مل) و b NT (300 مجم / مل) مع الاهتزاز.تشير الأسهم إلى اتجاه درجة الحرارة، ويصور التظليل الأخف لبيانات وحدة التخزين الاختبار عند قيم عزم دوران أقل للجهاز مما حددته الشركة المصنعة، وهو سبب زيادة الضوضاء.ج تراكم الوحدة النهائية لـ His-NT2RepCT و NT بعد ارتفاع درجة الحرارة (100 و 300 و 500 مجم / مل).يتم أخذ جميع قراءات الوحدة بتردد 0.1 هرتز.
كطريقة محتملة لدراسة التغيرات التوافقية المرتبطة بالجيل، سجلنا أطياف FTIR لـ His-NT2RepCT وNT قبل وبعد الجيل عند 37 درجة مئوية (الشكل 3 أ، ب).كما هو متوقع، تتوافق أطياف محاليل His-NT2RepCT وNT مع البروتينات التي تظهر البنية الثانوية للملف الحلزوني ألفا/العشوائي، مع نطاق واضح عند 1645 سم.بالنسبة لكلا الهلاميات المائية، أدى التبلور إلى تكوين ذراعين في النطاق I الأوسط عند حوالي 1617 سم-1 و1695 سم-1 (الشكل 3 أ، ب)، مما يشير إلى تكوين هياكل صفائح بيتا غير متوازية.يمكن أيضًا رؤية هذه التغييرات بوضوح في أطياف الجيل المشتقة والفرقية الثانية (الشكل التكميلي 4 ب).كان نطاقا طبقة NT β أكثر وضوحًا من نطاق His-NT2RepCT، مما يشير إلى أن المحتوى الإجمالي لنطاقات طبقة β في هيدروجيل NT كان أعلى من محتوى هيدروجيل NT2RepCT.
أطياف امتصاص FTIR لـ His-NT2RepCT وb NT (كلاهما 500 مجم / مل) قبل (المحلول) وبعد الحضانة (الجيل) عند 37 درجة مئوية.c صور TEM للمواد الهلامية NT2RepCT 50 ملغ / مل المعلقة و d NT.شريط النطاق 200 نانومتر.ه أقطار الألياف من الهلاميات المائية His-NT2RepCT و NT.n = 100 ألياف ليفية مقاسة، p <0.0001.تظهر أشرطة الخطأ الانحراف المعياري.مركز أشرطة الخطأ هو المتوسط.تم استخدام اختبار t غير المقترن (ثنائي الذيل) للتحليل الإحصائي.f مضان ThT لمختلف بروتينات سبيدروين المؤتلفة (100 مجم / مل) عند 37 درجة مئوية دون اهتزاز.تجارب تلقيح g NT (100 ملغ/مل) من جل NT 100 ملغ/مل مع بذور 0% و5% و10% و20%.
أظهر تحليل الجل باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) أن الهيدروجيل يتكون من ألياف ليفية تشبه الأميلويد (الأشكال 3 ج، 3 د).كانت الألياف الليفية المكونة من NT ممدودة (قطرها 5-12 نانومتر) وغير متفرعة ، في حين كانت الألياف الليفية His-NT2RepCT أقصر في الطول وأوسع قطرًا بشكل ملحوظ (7-16 نانومتر) (الشكل 3 هـ).أتاحت لنا هذه النتائج متابعة حركية التليف باستخدام مقايسة الثيوفلافين T (ThT).بالنسبة لجميع بروتينات السبيدروين المؤتلفة، زادت إشارة الفلورسنت عندما تم تحضين العينات عند 37 درجة مئوية (الشكل 3f، الشكل التكميلي 5 أ).تمشيا مع هذه النتيجة ، كشف الفحص المجهري لـ NT و His-NT2RepCT في ظل ظروف التبلور عن زيادة موحدة في مضان ThT دون تراكم محلي ملحوظ للركام الإيجابي ThT (الشكل التكميلي 5 ب ، ج).لم يكن تكوين ألياف ليفية إيجابية ThT مصحوبًا بزيادة في تعكر NT و His-NTCT (الشكل التكميلي 5 د) ، مما يعني أن شبكة من الألياف في الجل يمكن أن تتشكل دون المساس بوضوح الجل.البذر عن طريق إضافة كميات صغيرة من الألياف المشكلة مسبقًا يمكن أن يسرع بشكل كبير تكوين الألياف لبعض الأميلويدات ولكن إضافة 5٪ أو 10٪ أو 20٪ (وزن / وزن) NT إلى محلول التخثر المائي NT.تأثير البذر (الشكل 3G).ربما يرجع ذلك إلى حقيقة أن الألياف الموجودة في الهيدروجيل ثابتة نسبيًا ولا يمكن استخدامها كبذور.
دفع السلوك غير المتوقع لبروتينات السبيدروين المؤتلفة عند درجات الحرارة المرتفعة إلى إجراء المزيد من دراسات التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (NMR) لتحديد التغيرات التوافقية المرتبطة بتكوين الهلام.أظهرت أطياف الرنين المغناطيسي النووي لمحاليل His-NT2RepCT المسجلة مع مرور الوقت عند 37 درجة مئوية أن CT لا يزال مطويًا جزئيًا، في حين اختفت إشارات NT و2Rep (الشكل 4 أ)، مما يشير إلى أنه كان NT و2Rep بشكل أساسي هو الذي يتحكم جزئيًا في تكوين His--. NT2RepCT هيدروجيل.تم أيضًا تخفيف إشارة الأشعة المقطعية إلى 20% من شدتها الأصلية، مما يشير إلى أن الأشعة المقطعية ثابتة أيضًا في الغالب ومدمجة في بنية الهيدروجيل.بالنسبة لجزء أصغر من الأشعة المقطعية، والذي يكون متنقلًا كما هو الحال في العينة المحتضنة مسبقًا وبالتالي يتم ملاحظتها بواسطة محلول الرنين المغناطيسي النووي، تفتقر الأطياف إلى إشارات للبقايا العشرة الأولى المنظمة، ربما بسبب صعوبة تثبيت الجزء المرفق من His-NT2Rep .كشف أطياف الرنين المغناطيسي النووي لحالة الهلاميات المائية -NT2RepCT عن الوجود السائد لحلزونات ألفا وطبقات، وبدرجة أقل، التشكل العشوائي للملف (الشكل 4 ب).أظهر تحليل التحول الكيميائي لبقايا الميثيونين الموجودة فقط في NT أن هذا المجال قد تم تحويله إلى بنية صفائح.أظهرت أطياف NT المعتمدة على الوقت في المحلول انخفاضًا موحدًا في شدة الإشارة (الشكل 4 ج)، وأظهرت الحالة الصلبة للرنين المغناطيسي النووي للهيدروجيلات NT أن معظم بقايا NT تم تحويلها إلى هياكل صفائح β (الشكل 4 د).لا يمكن تحديد شكل 2Rep بشكل منفصل بسبب ميله إلى التجميع.ومع ذلك ، فإن أطياف الرنين المغناطيسي النووي ذات الحالة الصلبة للجيلات المائية NTCT و His-NT2RepCT بدت متشابهة جدًا (الشكل 4 ب ؛ الشكل التكميلي 6 ب) ، مما يشير إلى أن 2Rep ساهم قليلاً في الجزء الهيكلي من هيدروجيل His-NT2RepCT.بالنسبة إلى الهلاميات المائية المقطعية، تم العثور على حلزونات ألفا وصفائح بيتا وهياكل ثانوية حلزونية عشوائية (الشكل التكميلي 6 د).يشير هذا إلى أن بعض أجزاء التصوير المقطعي تظل حلزونية ألفا بينما تصبح أجزاء أخرى صفائح بيتا.وبالتالي، تشير نتائج التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي إلى أن NT مهم لتكوين الهيدروجيل ويتحول أيضًا إلى شكل صفائح بيتا عند الاندماج مع 2Rep وCT.تمشيًا مع هذا، وجدنا مؤخرًا أن السوستة المكانية الأميلويدية من المحتمل أن تتشكل في جميع الحلزونات الخمسة لنطاق NT، وتنبأت خوارزمية فالتز بوجود منطقة أميلويدوجينية في الحلزون 1 (الشكل 4 هـ).
أطياف ثنائية الأبعاد لمحلول 15N-HSQC 10 ملغم/مل His-NT2RepCT قبل (الأزرق) وبعد 19 ساعة من الحضانة (الأحمر) عند 37 درجة مئوية.يُشار إلى القمم المتقاطعة الفردية في الطيف الأحمر وF24 وG136 وpolyA في الطيف الأزرق برموز الأحماض الأمينية ذات الحرف الواحد وأرقام البقايا.تُظهر الأشكال الداخلية اعتماد شدة الإشارة في الوقت المحدد للوحدات البنائية المحددة من مجالات NT و2Rep وCT.ب أطياف التردد الراديوي للحالة الصلبة (RFDR) من الهلاميات المائية His-NT2RepCT.تم تحديد الارتباطات بين بقايا Cα / Cβ التي لوحظت في أطياف RFDR من خلال المقارنة مع التحولات الكيميائية الببتيدية النموذجية والقيم المستمدة من الإحصائيات وبنيتها الثانوية.SSB - النطاق الجانبي الدوار.ج أطياف أحادية البعد لمحلول 15N-HSQC 10 ملغم / مل NT أثناء الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 36 ساعة.يظهر الشكل الداخلي الكثافة الحجمية مقابل الوقت.د أطياف RFDR الحالة الصلبة من الهلاميات المائية NT.يشار إلى الارتباطات بين بقايا Cα / Cβ وهياكلها الثانوية التي لوحظت في أطياف RFDR.e استنادًا إلى ملف تعريف ميل الرجفان NT45.79 من قاعدة بيانات Zipper (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).تظهر طاقة رشيد لنافذة تحول البرق المكانية لسداسي الببتيد بالسعرة الحرارية / مول.تشير الأشرطة الحمراء إلى سداسي الببتيدات ذات القابلية العالية للتليف (طاقة رشيد أقل من -23 كيلو كالوري/مول؛ أسفل الخط المنقط).تشير الأشرطة الخضراء إلى الأجزاء التي تحتوي على طاقات رشيد أعلى من العتبة وبالتالي تقل احتمالية تكوين سحابات استاتيكية.تم استبعاد الأجزاء التي تحتوي على البرولين من التحليل (بدون أعمدة).تشير المربعات إلى مناطق الداء النشواني التي تنبأت بها خوارزمية الفالس (https://waltz.switchlab.org).يوجد تسلسل بقايا الأحماض الأمينية لـ NT في الأعلى، وتظهر أنواع المخلفات الموجودة في البنية الثانوية (التي يحددها التحليل الطيفي للرنين المغناطيسي النووي للحالة الصلبة) باللون الأحمر.تم تحديد مواقع حلزونات NT α الخمسة على أنها (H1-H5) .
عند درجة الحموضة <6.5، يتضاءل HT، كونه مقاومًا للحرارة أو التسخين الناجم عن اليوريا.لتوضيح كيفية تأثير تمييع واستقرار NT على التبلور، تم التحكم في المحاليل التي تحتوي على 100 ملغم/مل NT عند درجة الحموضة 8 و7 و6 باستخدام اختبار انقلاب القارورة.عينات NT المحتضنة عند درجة الحموضة 8 و 7 تبلورت بعد 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، لكن هلام الرقم الهيدروجيني 8 بقي واضحًا، بينما أظهر هلام الرقم الهيدروجيني 7 راسبًا مرئيًا (الشكل 5 أ).في المقابل، لم يشكل المحلول الذي يحتوي على HT عند درجة حموضة 6 هلامًا، ويمكن رؤية راسب كبير بعد 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.يشير هذا إلى أن الدايمرات نفسها و/أو ثباتها العالي مقارنة بالمونومرات تمنع التبلور.لم يكن من المتوقع تكوين راسب لـ NT عند درجة الحموضة 7 و 6، حيث تم الإبلاغ عن أن NT قابل للذوبان عند 200 مجم / مل27، ويتجدد بسهولة بعد تمسخ الحرارة، ويحتفظ أيضًا بحلزون ألفا عند قيم أقل من الرقم الهيدروجيني 18. التفسير المحتمل لهذه التناقضات هو أن التجارب المبلغ عنها سابقا أجريت في درجة حرارة الغرفة أو أقل، أو بتركيزات بروتين منخفضة نسبيا.
اختبار انقلاب قارورة NT (100 مجم/مل) عند درجة الحموضة 8 و7 و6 و154 ملي مول كلوريد الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 8) بعد الحضانة عند 37 درجة مئوية.ب أطياف NT CD مع وبدون 154 ملي مولار NaF و 154 ملي مول كلوريد الصوديوم على التوالي.يتم تحويل الإهليلجية المولية عند 222 نانومتر إلى نسبة من الطيات الطبيعية.ج مقايسة انعكاس NT (100 ملغ / مل) NT * (37 درجة مئوية و 60 درجة مئوية)، NTA72R (37 درجة مئوية)، وصاحب-NT-L6 (37 درجة مئوية و 60 درجة مئوية).d أطياف القرص المضغوط لطفرات NT NT * و NTA72R و His-NT-L6.يتم تحويل الإهليلجية المولية عند 222 نانومتر إلى نسبة من الطيات الطبيعية.اختبار الانعكاس لـ NTFlSp وNTMiSp وتقليل NTMiSp (100 مجم/مل).شريط النطاق 5 ملم.f أطياف القرص المضغوط لـ NT و NTFlSp و NTMiSp و NTMiSp المخفض.يتم تحويل الإهليلجية المولية عند 222 نانومتر إلى نسبة من الطيات الطبيعية.تظهر أطياف NT الكاملة عند 25 درجة مئوية و95 درجة مئوية في الشكل التكميلي 8.
يحدد تركيز الملح الفسيولوجي التفاعلات الكهروستاتيكية بين الوحدات الفرعية NT وتقليص نقل NT إلى انخفاض الرقم الهيدروجيني 18.لقد وجدنا أن وجود 154 ملي مولار من كلوريد الصوديوم وNaF قد أدى بالفعل إلى منع التبلور، على التوالي (الشكل 5 أ، ب؛ الشكل التكميلي 2 ب) وأن هذه الأملاح زادت من الثبات الحراري لمونومرات NT (الشكل 5 ب، الشكل التكميلي 8). .كما يشير أيضًا إلى أن تعزيز الاستقرار، بدلاً من تقليص حجمه، يمنع تكوين الهلام.
لمزيد من استكشاف دور تمييع البروتين واستقراره في تكوين الجيلاتين، استخدمنا اثنين من المسوخات، NT* وNTA72R، والتي تظل أيضًا أحادية عند درجة الحموضة المنخفضة 28.30.NT* عبارة عن طفرة انعكاس شحنة مزدوجة حيث يتم تسطيح توزيع الشحنة ثنائي القطب الظاهر للمونومر، مما يمنع تقليص حجم المونومر ويزيد بشكل كبير من استقرار المونومر.NTA72R هو ثنائي القطب مشحون، لكن Ala المستبدل بـ Arg يقع عند الحدود الخافتة، لذلك تتداخل الطفرات مع تفاعلات الوحدات الفرعية المطلوبة لتقليص الحجم.عند الحضانة عند 37 درجة مئوية، لم يشكل NT* هيدروجيل، بينما شكل NTA72R هلامًا معتمًا لمدة 15 دقيقة (الشكل 5 ج).نظرًا لأن كلاً من NT * و NTA72R لا يمكنهما تقليص حجمهما ولكنهما يختلفان في ثبات المونومر (الشكل 5 د) ، فإن هذه النتائج تشير بقوة إلى أن الثبات الديناميكي الحراري العالي يمنع NT من التبلور.ويدعم هذا أيضًا حقيقة أن HT* يشكل هلامًا عندما يكون غير مستقر عند درجة حرارة عالية (بعد 8 دقائق عند 60 درجة مئوية؛ الشكل 5 ج).لقد سبق أن تبين أن المحتوى العالي من الميثيونين في NT يسيل طيه الطبيعي وأن ستة بدائل Met to Leu (يشار إليها هنا باسم His-NT-L6) تعمل بقوة على تثبيت مونومر NT46.استنادا إلى الافتراض بأن المرونة الهيكلية مطلوبة لتشكيل هلام NT، وجدنا أن المتحولة المستقرة له-NT-L6 لم هلام عند 37 درجة مئوية (الشكل 5C، د).ومع ذلك، قام His-NT-L6 أيضًا بتكوين هلام عند الحضانة عند درجة حرارة 60 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة (الشكل 5 ج).
يبدو أن قدرة NT على التحول إلى هياكل صفائحية وتشكيل الهلاميات المائية تنطبق على بعض مجالات NT الخاصة بسبيدروين وليس جميعها.NTs من أنواع مختلفة من الحرير وأنواع العنكبوت ، Trichonephila clavipes (NTFlSp) ، شكلت مواد هلامية على الرغم من محتواها المنخفض نسبيًا من الميثيونين والثبات الحراري العالي (الشكل 5e و f والجدول التكميلي 2).على النقيض من ذلك ، فإن NT من البروتين الأمبولي الصغير سبيدروين من Araneus ventricosus (NTMiSp) مع الثبات الحراري المنخفض والمحتوى العالي من الميثيونين لم يشكل الهلاميات المائية (الجدول التكميلي 2 والشكل 5 هـ ، و).قد يرتبط الأخير بوجود روابط ثاني كبريتيد داخل الجزيئات .على نحو متسق، عندما تم تخفيض روابط ثاني كبريتيد NTMiSp، شكل هيدروجيل بعد الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق (الشكل 5 هـ).في الختام، تجدر الإشارة إلى أن المرونة الهيكلية هي معيار مهم، ولكن ليس الوحيد، لتشكيل مادة هلامية من NT.هناك عامل آخر قد يكون ذا صلة وهو الميل إلى تكوين ألياف أميلويد، وقد أظهر التحليل باستخدام قاعدة بيانات السوستة وخوارزمية فالتز وجود علاقة بين القدرة على تكوين المواد الهلامية ووجود المناطق الأميلويدية، بالإضافة إلى مدى المناطق المتوقعة لتشكيل السوستة الاستاتيكية.كان هناك ارتباط (الجدول التكميلي 2 والشكل التكميلي 9).
إن قدرة NT على تكوين ألياف ليفية وتشكيل مواد هلامية في ظل ظروف مواتية قادتنا إلى افتراض أن اندماج NT مع شظايا البروتين الأخرى لا يزال من الممكن أن يشكل مواد هلامية مع الوظيفة الكاملة لشركاء الاندماج.لاختبار هذا، قدمنا ​​البروتين الفلوري الأخضر (GFP) وفسفوريلاز نوكليوزيد البيورين (PNP) في الطرف C من NT، على التوالي.تم التعبير عن بروتينات الاندماج الناتجة في E. coli مع عوائد نهائية عالية جدًا (150 مجم / لتر و 256 مجم / لتر من ثقافات قارورة الاهتزاز لـ His-NT-GFP و His-NT-PNP، على التوالي)، بما يتوافق مع ما تم عرضه للبروتينات الأخرى المندمجة في NT المرجع.30. شكلت بروتينات الاندماج His-NT-GFP (300 مجم/مل) وبروتينات الاندماج His-NT-PNP (100 مجم/مل) مواد هلامية بعد ساعتين و6.5 ساعة عند 37 درجة مئوية، والأهم من ذلك، بقي جزء GFP دون تغيير.لوحظ بعد التبلور، مع بقاء> 70٪ من شدة التألق الأولية بعد التبلور (الشكل 6 أ).لقياس نشاط PNP في محاليله والمواد الهلامية NT-PNP، كان علينا تخفيف بروتين الاندماج مع NT لأن النشاط الأنزيمي للمستحضر النقي كان خارج نطاق الكشف عن الفحص عند تركيزات التبلور.احتفظ الجل المتكون بخليط يحتوي على 0.01 مجم / مل His-NT-PNP و 100 مجم / مل NT بنسبة 65٪ من النشاط الأنزيمي الأولي للعينات المحتضنة مسبقًا (الشكل 6 ب).ظل الجل سليمًا أثناء القياس (الشكل التكميلي 10).
كثافة مضان نسبية قبل وبعد جيل من His-NT-GFP (300 مجم/مل) وقنينة مقلوبة تحتوي على هيدروجيل His-NT-GFP (300 مجم/مل) تحت الضوء المرئي والأشعة فوق البنفسجية.تظهر النقاط القياسات الفردية (ن = 3)، وتظهر أشرطة الخطأ الانحراف المعياري.تظهر القيمة المتوسطة في وسط أشرطة الخطأ.تم الحصول على نشاط PNP من خلال التحليل الفلوري باستخدام المحاليل والمواد الهلامية التي تتكون من NT (100 مجم / مل) وخليط يحتوي على 0.01 مجم / مل من his-NT-PNP و 100 مجم / مل من دولارات تايوان الجديدة.يُظهر الشكل الداخلي قارورة مقلوبة تحتوي على هيدروجيل يحتوي على His-NT-PNP (شريط مقياس 5 مم).
هنا، نقوم بالإبلاغ عن تكوين الهلاميات المائية من NT وغيرها من بروتينات السبيدروين المؤتلفة عن طريق احتضان محلول البروتين عند 37 درجة مئوية (الشكل 1).لقد أظهرنا أن التجلُّم يرتبط بتحول حلزونات ألفا إلى طبقات بيتا وتكوين ألياف ليفية تشبه الأميلويد (الشكلان 3 و4).يعد هذا الاكتشاف مفاجئًا نظرًا لأن NTs عبارة عن حزم حلزونية كروية ملفوفة معروفة بقدرتها العالية على الذوبان والثبات العالي عند تركيزات> 200 مجم / مل عند 4 درجات مئوية لعدة أيام .بالإضافة إلى ذلك، يمكن إعادة طي NTs بسهولة بعد تمسخ الحرارة بتركيزات منخفضة من البروتين في ميكرومتر.وفقًا لنتائجنا، يتطلب تكوين اللييفات مزيجًا من تركيز البروتين> 10 ملغم/مل ودرجة حرارة مرتفعة قليلاً (الشكل 1).وهذا يتفق مع فكرة أن ألياف الأميلويد يمكن أن تتشكل من بروتينات مطوية بشكل كروي والتي تكون في حالة غير مطوية جزئيًا بسبب التقلبات الحرارية في ظل الظروف الفسيولوجية 48 .تتضمن أمثلة البروتينات التي تخضع لهذا التحويل الأنسولين 49،50، β2-microglobulin، transthyretin وlysozyme51،52،53.على الرغم من أن NT عبارة عن حلزون α في حالته الأصلية، إلا أن ما يقرب من 65٪ من سلسلة البولي ببتيد متوافقة مع تكوين السحاب الاستاتيكي (الشكل 4 هـ) 45.نظرًا لأن المونومر متحرك ديناميكيًا 46 ، فإنه يمكن أن يعرض هذه المناطق الأميلويدية المحتملة عند درجات حرارة مرتفعة بشكل معتدل وفي تركيزات عالية من البروتين الكلي يمكن أن يصل إلى تركيز حرج لتكوين ليفي الأميلويد .باتباع هذا المنطق، وجدنا علاقة سلبية بين تركيز السبيدروين وزمن التبلور (الشكل 1 ج)، وإذا تم تثبيت التشكل الأحادي NT إما عن طريق الطفرات (NT*، His-NT-L6) أو عن طريق إضافة الملح، فيمكن أن يمنع حدوث ذلك. تشكيل الهلاميات المائية (الشكل 5).
في معظم الحالات، تختفي ألياف الأميلويد من المحلول على شكل راسب، ولكن في ظل ظروف معينة يمكن أن تشكل الهلاميات المائية 55،56،57.عادةً ما تحتوي الألياف المكونة للهيدروجيل على نسبة عرض إلى ارتفاع عالية وتشكل شبكات مستقرة ثلاثية الأبعاد من خلال التشابك الجزيئي، بما يتوافق مع نتائجنا.بالنسبة لتكوين الهيدروجيل في المختبر، غالبًا ما يتم الكشف عن البروتينات بشكل كامل أو جزئي، على سبيل المثال، عن طريق التعرض للمذيبات العضوية ودرجة الحرارة المرتفعة (70-90 درجة مئوية) و/أو الرقم الهيدروجيني المنخفض (1.5-3.0) 59،60،61،62.الهلاميات المائية spidroin الموصوفة هنا لا تتطلب معالجة قاسية، كما أنها لا تتطلب عوامل ربط متقاطع لتحقيق الاستقرار في الهلاميات المائية.
لقد تم الإبلاغ سابقًا عن أن تكرارات السبيدروين ونقاط الكمية، التي يبدو أنها تخضع لتبديل الصفائح أثناء غزل الحرير، تشكل الهلاميات المائية.بالمقارنة مع النتائج التي توصلنا إليها، كانت أوقات الحضانة و/أو درجات حرارة الحضانة أطول أو أعلى بكثير، على التوالي، وكانت الهلاميات المائية الناتجة في كثير من الأحيان غير شفافة (الشكل 7 والجدول التكميلي 1) 37، 38، 63، 64، 65، 66، 67، 68 ، 69. بالإضافة إلى أوقات الهلام السريعة، تفوقت الهلاميات المائية NT> 300 ملغم / مل (30٪) على جميع الهلاميات المائية المائية الأخرى الموصوفة ببروتين حرير العنكبوت المؤتلف، بالإضافة إلى الهلاميات المائية الطبيعية مثل الجيلاتين والجينات (2٪) والأجار (0.5٪). ) والكولاجين.(0.6٪) (الشكل 7 والجدولان التكميليان 1 و 3) 37،39،66،67،68،69،70،71،72،73،74.
وتمت مقارنة وقت الجل والمعامل المرن للهيدروجيلات في هذه الدراسة مع الهلاميات المائية الأخرى المستندة إلى السبيدروين والهلاميات المائية الطبيعية المختارة.وترد المراجع جنبا إلى جنب مع وصف لظروف هلام.APS كبريتات الأمونيوم، في درجة حرارة الغرفة.البيانات 37، 38، 39، 64، 65، 66، 67، 68، 69، 70، 71، 72، 73، 74.
يبدو أن العناكب قد طورت طرقًا لمنع السبيدروين من التبلور أثناء التخزين.على الرغم من التركيز العالي للبروتين في غدة الحرير، فإن منطقة التكرار الكبيرة المرتبطة بالمجال الطرفي تعني أن التركيز الظاهر للـ NT وCT في الغدة يتوافق مع حوالي 10-20 مجم/مل، عند حدود هذه الدراسة.اللازمة لتكوين هيدروجيل في المختبر.بالإضافة إلى ذلك، استقرت تركيزات مماثلة من الأملاح 16 NT، كما هو الحال في الغدد الحريرية (الشكل 5 ب).تمت دراسة التشكل NT في العصارة الخلوية للإشريكية القولونية ووجد أنها مطوية بشكل أكثر إحكامًا مما كانت عليه عند فحصها في المختبر، مما يشير أيضًا إلى أن الملح أو عوامل أخرى تمنع تراكمها في الجسم الحي.ومع ذلك، فإن قدرة NTs على التحول إلى ألياف ليفية ذات صفائح بيتا قد تكون مهمة لتكوين الخيوط ويجب دراستها في الدراسات المستقبلية.
بالإضافة إلى الجوانب الجديدة لتكوين اللييفات والهيدروجيل الشبيه بالأميلويد NT التي لوحظت في هذه الدراسة، نظهر أيضًا أن هذه الظاهرة قد يكون لها تطبيقات تكنولوجية حيوية وطبية حيوية (الشكل 8).كدليل على المفهوم، قمنا بدمج NT مع GFP أو PNP وأظهرنا أن بروتين الاندماج يشكل أيضًا الهلاميات المائية عند حضنه عند 37 درجة مئوية وأن كسور GFP وPNP تحتفظ بنشاطها إلى حد كبير بعد التجيل (الشكل 6).تعد فسفوريلاز النيوكليوسيد من المحفزات المهمة لتخليق نظائرها النيوكليوزيدية75، مما يجعل اكتشافنا ذا صلة بصناعة المستحضرات الصيدلانية الحيوية.إن مفهوم التعبير عن بروتينات الاندماج التي تشكل الهلاميات المائية الشفافة في ظل ظروف مواتية يسمح بإنشاء الهلاميات المائية الوظيفية ذات الخصائص المفضلة لمجموعة واسعة من التطبيقات مثل تجميد الإنزيم وإطلاق الأدوية الخاضعة للرقابة وهندسة الأنسجة.بالإضافة إلى ذلك، NT وNT* هما علامات تعبير فعالة، مما يعني أنه يمكن استخدام NT ومتغيراته لإنتاج إنتاجية عالية من بروتينات الاندماج القابلة للذوبان وإنشاء بروتينات مستهدفة ثابتة في الهلاميات المائية ثلاثية الأبعاد.
NT قابل للذوبان وحلزوني ألفا ومستقر عند تركيزات منخفضة (ميكرومتر) و37 درجة مئوية.في نفس درجة الحرارة، ولكن بتركيزات متزايدة (> 10 ملغم / مل)، يشكل NT مواد هلامية تتكون من ألياف ليفية تشبه الأميلويد.تشكل بروتينات الاندماج NT أيضًا مواد هلامية ليفية مع شظايا اندماج كاملة الوظائف، مما يسمح بتجميد البروتينات المختلفة في الهلاميات المائية ثلاثية الأبعاد باستخدام NT.الأسفل: NT (PDB: 4FBS) والرسوم التوضيحية لشبكات الألياف وهياكل البروتين المرتبطة بها (المفترضة وغير المرسومة على نطاق واسع، GFP PDB: 2B3Q، 10.2210 / pdb2B3Q / pdb؛ PNP PDB: 4RJ2، 10.2210 / pdb4RJ2 / pdb).
تم استنساخ التركيبات (انظر الجدول التكميلي 4 للحصول على قائمة كاملة بما في ذلك تسلسل الأحماض الأمينية) إلى البلازميد pT7 وتحويلها إلى E. coli BL21 (DE3).تم تلقيح الإشريكية القولونية التي تحتوي على البلازميدات المهندسة في مرق لوريا المضاف إليه الكاناميسين (70 مجم / لتر) ونمت طوال الليل عند 30 درجة مئوية و250 دورة في الدقيقة.تم بعد ذلك تلقيح المزرعة بنسبة 1/100 في وسط LB يحتوي على الكاناميسين وتم زراعتها عند 30 درجة مئوية و110 دورة في الدقيقة حتى وصل OD600 إلى 0.8.بالنسبة لدراسات الرنين المغناطيسي النووي، تم زراعة البكتيريا في وسط الحد الأدنى M9 الذي يحتوي على 2 جرام من D-glucose 13C (Aldrich) و1 جرام من كلوريد الأمونيوم 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) لوضع العلامات على البروتين بالنظائر.خفض درجة الحرارة إلى 20 درجة مئوية والحث على التعبير البروتين مع 0.15 ملي إيزوبروبيل ثيوجالاكتوبرانوسيد (التركيز النهائي).بعد التعبير عن البروتين طوال الليل، تم حصاد الخلايا عند 7278 × جم، 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.تمت إعادة تعليق كريات الخلايا في 20 ملي مولار من حمض تريس-حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8، وتجميدها حتى استخدامها مرة أخرى.تم التخلص من الخلايا المذابة باستخدام جهاز تعطيل الخلايا (آلات سلسلة TS، شركة Constant Systems Limited، إنجلترا) عند 30 كيلو باسكال.ثم تم الطرد المركزي للمحلول عند 25000 جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.بالنسبة لـ NTMiSp، تم بعد ذلك إعادة تعليق الحبيبة في 2 مولار من اليوريا، و20 مللي مولار Tris-HCl، ودرجة الحموضة 8، وصوتنة لمدة دقيقتين (ثانيتين تشغيل/إيقاف، 65%)، ثم تم طردها مرة أخرى عند 25000 x جم، 4 درجات مئوية خلال 30 دقيقة.تم تحميل الطاف على عمود Ni-NTA، وغسله بـ 20 ملي مولار من حمض الهيدروكلوريك Tris-HCl، و2 ملي مولار إيميدازول، ودرجة الحموضة 8، وأخيرًا تمت تصفية البروتين باستخدام 20 ملي مولار من حمض الهيدروكلوريك Tris-HCl، و200 ملي مولار إيميدازول، ودرجة الحموضة 8. لتوليد NT2RepCT و NTCT، هضم الثرومبين يدخل الموقع (ThrCleav) بين His وNT.مواقع انقسام الثرومبين موجودة أيضًا في His-NT-ThrCleav-2Rep (ينتج 2Rep)، His-thioredoxin-ThrCleav-NT (ينتج NT)، His-thioredoxin-ThrCleav-CT (ينتج CT)، His-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (ينتج NT*)، His-Thoredoxin-ThrCleav-NTA72R (ينتج NTA72R)، His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (ينتج NTF1Sp)، وHis-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (ينتج NTMiSp).تم هضم التركيبات باستخدام الثرومبين (1: 1000) وتمت غسيلها طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع 20 ملي مولار Tris-HCl، الرقم الهيدروجيني 8، باستخدام غشاء غسيل الكلى Spectra/Por مع عتبة وزن جزيئي تبلغ 6-8 كيلو دالتون.بعد غسيل الكلى، يتم تحميل المحلول على عمود Ni-NTA ويتم جمع النفايات السائلة التي تحتوي على البروتين محل الاهتمام.تم تحديد تركيزات البروتين عن طريق قياس امتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند 280 نانومتر باستخدام معامل الانقراض لكل بروتين، باستثناء NTF1Sp، الذي استخدم اختبار برادفورد وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة.تم تحديد النقاء بواسطة SDS بولي أكريلاميد (4-20٪) الكهربائي للهلام وتلطيخ Coomassie الأزرق الرائع.تم تركيز البروتينات باستخدام مرشحات الطرد المركزي (VivaSpin 20، GE Healthcare) عند 4000 x جرام مع قطع وزن جزيئي قدره 10 كيلو دالتون في دورات مدتها 20 دقيقة.
قم بإذابة محلول البروتين وقم بالماصة بعناية 150 ميكرولتر في قارورة حاجزة شفافة سعة 1 مل (8 × 40 ملم الحرارية العلمية).تم تغطية الأنابيب وإغلاقها بطبقة بارافيلم لمنع التبخر.تم تحضين العينات (ن = 3) عند 37 درجة مئوية أو 60 درجة مئوية وقلبها بشكل دوري لمراقبة التبلور.تم تحضين العينات التي لم تتكون هلامية لمدة أسبوع واحد على الأقل.تقليل سندات ثاني كبريتيد NTMiSp مع 10 ملم DTT لكل 10 ميكرومتر من البروتين.لتحليل تكوّن طبقات حرير العنكبوت الطبيعية، تم قطع عنكبوت الجسر السويدي، ووضعت الغدتين الرئيسيتين المتبلورتين في 200 ميكرولتر من 20 ملي مولار من محلول Tris-HCl pH 8 وقطعهما للسماح للطلاء بالانفصال عن الغدد..يتم إذابة محتويات الغدد في المخزن المؤقت، 50 ميكرولتر لتحديد الوزن الجاف (عن طريق حضانة قوارير مفتوحة عند 60 درجة مئوية لوزن ثابت) و150 ميكرولتر للجيل عند 37 درجة مئوية.
هندسة/أداة القياس مصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ باستخدام لوحة متوازية بقطر علوي 20 مم وفجوة 0.5 مم.تسخين العينة من 25 درجة مئوية إلى 45 درجة مئوية والعودة إلى 25 درجة مئوية بمعدل 1 درجة مئوية في الدقيقة باستخدام لوحة بلتيير أسفل الفولاذ المقاوم للصدأ.تم إجراء قياسات الاهتزازات بتردد 0.1 هرتز وفي المنطقة اللزجية المرنة الخطية للمادة عند إجهاد قدره 5% و0.5% لعينات تبلغ 100 مجم/مل و300-500 مجم/مل على التوالي.استخدم غرفة رطوبة مخصصة لمنع التبخر.تم تحليل البيانات باستخدام بريزم 9.
لجمع أطياف الأشعة تحت الحمراء (IR) في درجة حرارة الغرفة من 800 إلى 3900 سم-1.يتم تطهير جهاز ATR، وكذلك مسار الضوء من خلال مقياس الطيف، بالهواء الجاف المفلتر قبل وأثناء التجربة.تم بيبيتيد الحلول (500 ملغ/مل لتقليل قمم امتصاص الماء في الأطياف) على البلورات، وتم تشكيل المواد الهلامية (500 ملغ/مل) قبل القياس ثم نقلها إلى البلورات (ن = 3).تم تسجيل 1000 عملية مسح بدقة 2 سم -1 ودورة تشغيل صفرية قدرها 2. وتم حساب المشتق الثاني باستخدام OPUS (Bruker) باستخدام نطاق تجانس من تسع نقاط.تم تطبيع الأطياف إلى نفس منطقة التكامل بين 1720 و1580 سم-1 باستخدام برنامج F. Menges "Spectragryph – Optical Spectroscopy Software".في التحليل الطيفي ATR-IR، يعتمد عمق اختراق شعاع الأشعة تحت الحمراء في العينة على الرقم الموجي، مما يؤدي إلى امتصاص أقوى عند أرقام الموجات المنخفضة مقارنةً بأرقام الموجات الأعلى.لم يتم تصحيح هذه التأثيرات للأطياف الموضحة في الشكلين.3 لأنها صغيرة جدًا (الشكل التكميلي 4).تم حساب الأطياف المصححة لهذا الرقم باستخدام برنامج Bruker OPUS.
من حيث المبدأ، من الممكن إجراء تقدير كمي شامل لمطابقات البروتين بعد تفكيك موثوق للمكونات داخل ذروة الأميد الأول.ومع ذلك، تنشأ بعض العقبات في الممارسة العملية.يمكن أن تظهر الضوضاء في الطيف على شكل قمم (كاذبة) أثناء عملية الالتفاف.وبالإضافة إلى ذلك، فإن الذروة الناجمة عن انحناء الماء تتزامن مع موضع ذروة الأميد I وقد يكون لها حجم مماثل بالنسبة للعينات التي تحتوي على كمية كبيرة من الماء، مثل الهلام المائي الذي تمت دراسته هنا.لذلك، لم نحاول تحلل ذروة الأميد I بشكل كامل، ويجب أن تؤخذ ملاحظاتنا في الاعتبار فقط لدعم الطرق الأخرى مثل التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي.
تم تبلور محاليل 50 ملغم / مل NT و His-NT2RepCT طوال الليل عند 37 درجة مئوية.تم بعد ذلك تخفيف الهيدروجيل باستخدام 20 ملي مولار من حمض الهيدروكلوريك Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 8) إلى تركيز 12.5 مجم/مل، وتم رجه جيدًا وتمريره بالماصة لتكسير الجل.بعد ذلك، تم تخفيف الهيدروجيل 10 مرات باستخدام 20 ملي مولار من حمض تريس-حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8)، وتم تطبيق 5 ميكرولتر من العينة على شبكة نحاسية مطلية بمادة فورمفار، وتمت إزالة العينة الزائدة باستخدام ورق نشاف.تم غسل العينات مرتين باستخدام 5 ميكرولتر من ماء MilliQ وصبغها بـ 1٪ من فورمات اليورانيل لمدة 5 دقائق.قم بإزالة البقع الزائدة باستخدام ورق ماص، ثم جفف الشبكة بالهواء.تم إجراء التصوير على هذه الشبكات باستخدام FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN الذي يعمل بسرعة 100 كيلو فولت.تم تسجيل الصور بمعدل تكبير × 26500 و × 43000 باستخدام كاميرا Veleta 2k × 2k CCD (Olympus Soft Imaging Solutions، GmbH، Münster، ألمانيا).لكل عينة (ن = 1)، تم تسجيل 10-15 صورة.تم استخدام ImageJ (https://imagej.nih.gov/) لتحليل الصور وقياس أقطار الألياف (ن = 100، ألياف مختلفة).تم استخدام المنشور 9 لإجراء اختبارات t غير المقترنة (ثنائي الذيل).كان متوسط ​​ألياف ليفية His-NT2RepCT وNT 11.43 (SD 2.035) و7.67 (SD 1.389) نانومتر، على التوالي.فاصل الثقة (95%) هو -4.246 إلى -3.275.درجات الحرية = 198، ع <0.0001.
تم قياس 80 ميكرولتر من العينات السائلة التي تحتوي على 10 ميكرومتر ثيوفلافين T (ThT) في ثلاث نسخ (ن = 3) في ظل ظروف ثابتة باستخدام ألواح قاع شفافة من كورنينج 96-جيدا باللون الأسود (Corning Glass 3881، الولايات المتحدة الأمريكية).تم تسجيل اختلافات الإسفار باستخدام مرشح إثارة 440 نانومتر وفلتر انبعاث 480 نانومتر (FLUOStar Galaxy من BMG Labtech، Offenburg، ألمانيا).لم تكن إشارة ThT مشبعة أو مطفأة، حيث تم إجراء تجارب بتركيزات مختلفة من ThT دون تغيير شدة الإشارة.سجل الامتصاص عند 360 نانومتر لقياس الضباب.بالنسبة لتجارب البذر، تم تكوين 100 ملغم/مل من المواد الهلامية عند 37 درجة مئوية، وتم إعادة تعليقها واستخدامها للبذر بنسب مولية 5%، 10%، و20%.تم تحليل البيانات باستخدام بريزم 9.
ذوبان مخزونات His-NT2RepCT وNT > 100 ملغم/مل على الجليد وتصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر.تم حساب التركيزات عن طريق قياس الامتصاصية عند 280 نانومتر باستخدام Nanodrop.في الآبار المكونة من 96 لوحة سوداء غير ملزمة (كورنينج) ذات قاع واضح، تم تخفيف العينات إلى 20 مجم / مل في 20 مللي مولار Tris-HCl pH 8 وخلطها مع 5 ميكرومتر ThT (التركيز النهائي)، إجمالي تركيز العينة حجم 50 ميكرولتر.تم تصوير العينات كل 10 دقائق عند 37 درجة مئوية على مجهر CellObserver (Zeiss) مع قناة الضوء المرسلة ومجموعات مرشح الإثارة والانبعاثات FITC لتصوير ThT.يتم استخدام عدسة 20x/0.4 للتصوير.تم استخدام Zen Blue (Zeiss) وImageJ (https://imagej.nih.gov/) لتحليل الصور.تم تحضير المواد الهلامية أيضًا من محاليل NT وHis-NT2RepCT بتركيز 50 ملغم / مل تحتوي على 20 ملي مولار تريس pH 8 و5 ميكرومتر ThT وحضنت عند 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.تم نقل قطع الهلام إلى بئر جديد يحتوي على 20 ملي مولار تريس ودرجة الحموضة 8 و5 ميكرومتر ThT في لوحة سفلية سوداء واضحة 96 غير ملزمة.الحصول على مضان أخضر وصور ميدانية مشرقة عند التكبير 20x/0.4.تم استخدام ImageJ لتحليل الصور.
تم الحصول على أطياف محلول الرنين المغناطيسي النووي عند 310 كلفن على مطياف Bruker Avance Neo بتردد 600 ميجاهرتز والمجهز بمسبار التبريد ذو الرنين الرباعي الرنين النبضي (HFCN).عينات الرنين المغناطيسي النووي التي تحتوي على 10 ملغ/مل من البروتين المتجانس المسمى بـ 13C، 15N، المذاب في 20 مم Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 8)، 0.02% (w/v) NaN3، 5% D O (v/v)، (n = 1) .تم استخدام التحولات الكيميائية لـ NT2RepCT عند درجة الحموضة 6.7 لتعيين الذروة 23 في الطيف ثنائي الأبعاد لـ 15N-HSQC.
تم تسجيل أطياف الرنين المغناطيسي النووي الصلبة (MAS) ذات الزاوية السحرية التي تبلغ 13 درجة مئوية والهلاميات المائية التي تحمل علامة 15N على مطياف Bruker Avance III HD بسرعة 800 ميجا هرتز ومجهز بمسبار غير إلكتروني 3.2 مم 13C / 15N {1H}.تم التحكم في درجة حرارة العينة باستخدام تيار غاز متغير الحرارة عند 277 كلفن. وتم الحصول على أطياف الرنين الدوراني ثنائي القطب (DARR) وإعادة توصيل الترددات الراديوية (RFDR) 77 عند ترددات MAS البالغة 12.5 كيلو هرتز و20 كيلو هرتز، على التوالي.تم إجراء الاستقطاب المتقاطع (CP) من 1H إلى 13C باستخدام منحدر خطي من 60.0 إلى 48.0 كيلو هرتز عند 1H، 61.3/71.6 كيلو هرتز عند 13 درجة مئوية (عند 12.5/20 كيلو هرتز MAS) ووقت الاتصال 0.5-1 مللي ثانية.تم استخدام فصل Spinal6478 عند 73.5 كيلو هرتز أثناء جمع البيانات.كان وقت الاستحواذ 10 مللي ثانية وكان تأخير الدورة 2.5 ثانية.تم تعيين الارتباطات Cα / Cβ أحادية الارتباط التي لوحظت في أطياف RFDR بناءً على التحولات الكيميائية المميزة من نوع البقايا والعلاقات المرتبطة المتعددة في أطياف DARR.
تم استخدام قاعدة بيانات Zipper79 (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) لتقييم ميول الرفرفة وطاقة رشيد لـ NT وNTFlSp وNTMiSp.تقوم قاعدة بيانات Zipper بحساب Rosetta Energy80، الذي يجمع بين العديد من وظائف الطاقة المجانية لنمذجة وتحليل بنية البروتين.يشير مستوى الطاقة الذي يبلغ -23 كيلو كالوري/مول أو أقل إلى وجود ميل كبير للرجفان.تعني الطاقة المنخفضة مزيدًا من الثبات للخيطين في شكل السحاب.بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام خوارزمية Waltz للتنبؤ بالمناطق الأميلويدوجينية في NT وNTFlSp وNTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
تم خلط محلول البروتين NT مع محلول حمض الإيثان سلفونيك (MES) 2- (N-morpholino) عند الرقم الهيدروجيني 5.5 و6.0 لخفض الرقم الهيدروجيني إلى الرقم الهيدروجيني 6 و7، على التوالي.كان تركيز البروتين النهائي 100 مجم / مل.
تم إجراء القياسات على مطياف J-1500 CD (JASCO، الولايات المتحدة الأمريكية) باستخدام كفيت 300 ميكرولتر مع مسار بصري يبلغ 0.1 سم.تم تخفيف البروتينات إلى 10 ميكرومتر (ن = 1) في محلول فوسفات 20 ملم (الرقم الهيدروجيني 8).لتحليل ثبات البروتين في وجود الملح، تم تحليل البروتينات بنفس التركيز (ن = 1) في محلول فوسفات 20 ملي مولار (الرقم الهيدروجيني 8) يحتوي على 154 ملي مولار NaF أو كلوريد الصوديوم، على التوالي.تم تسجيل فحوصات درجة الحرارة عند 222 نانومتر من 25 درجة مئوية إلى 95 درجة مئوية بمعدل تسخين 1 درجة مئوية / دقيقة.تم حساب نسبة البروتينات المطوية أصلاً باستخدام الصيغة (KDmeasure - KDfinal) / (KDstart - KDfinal).بالإضافة إلى ذلك، تم تسجيل خمسة أطياف لكل عينة من 260 نانومتر إلى 190 نانومتر عند 25 درجة مئوية وبعد التسخين إلى 95 درجة مئوية.تم حساب متوسط ​​خمسة أطياف وتنعيمها وتحويلها إلى إهليلجية مولية.تم تحليل البيانات باستخدام بريزم 9.
تم قياس شدة التألق لـ His-NT-GFP (300 مجم/مل، 80 ميكرولتر) في ثلاث نسخ (ن = 3) في صفائح كورنينج ذات 96 بئرًا ذات قاع أسود شفاف (كورنينج جلاس 3881، الولايات المتحدة الأمريكية) في ظل ظروف ثابتة.قياس العينات مع قارئ لوحة على أساس مضان مع الطول الموجي الإثارة من 395 نانومتر وتسجيل الانبعاثات عند 509 نانومتر قبل التبلور وبعد ساعتين عند 37 درجة مئوية.تم تحليل البيانات باستخدام بريزم 9.
تم استخدام مجموعة مقايسة نشاط فسفوريلاز البيورين نوكليوسيد (طريقة قياس الفلور، سيجما ألدريش) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة.لقياس النشاط في المواد الهلامية والحلول التي تحتوي على His-NT-PNP، قم بخلط 10 نانوغرام من His-NT-PNP مع 100 ملغ/مل NT إلى إجمالي حجم 2 ميكرولتر لأن الجل أعطى إشارة فوق الفاصل الزمني للكشف عن المجموعة.تم تضمين الضوابط للمواد الهلامية والحلول دون صاحب-NT-PNP.تم إجراء القياسات مرتين (ن = 2).بعد قياس النشاط، تمت إزالة خليط التفاعل وتصوير الهلام للتأكد من بقاء الهلام سليمًا أثناء القياس.تم تحليل البيانات باستخدام بريزم 9.
لمزيد من المعلومات حول تصميم الدراسة، راجع ملخص دراسة الطبيعة المرتبط بهذه المقالة.
يعرض الشكلان 1 و 2 البيانات الأولية.1c، 2a – c، 3a، b، e – g، 4، 5b، d، f، and 6، الأشكال التكميلية.3، الشكل التكميلي.5 أ، د، الشكل التكميلي.6 والشكل التكميلي.8. البيانات تتم استضافة بيانات هذه الدراسة في قاعدة بيانات Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.تم نشر بيانات الرنين المغناطيسي النووي التي تم الحصول عليها في هذه الدراسة إلى مستودع BMRBig تحت معرف الإدخال bmrbig36.تم أخذ هياكل GFP وPNP من PDB (GFP 2B3Q، PNP 4RJ2).
Rising، A. and Johansson، J. غزل حرير العنكبوت الاصطناعي.الكيميائية الوطنية.مادة الاحياء.11، 309-315 (2015).
باب، بل وآخرون.يسلط جينوم Nephila clavipes الضوء على تنوع جينات حرير العنكبوت وتعبيرها المعقد.جينيت الوطنية.49، 895-903 (2017).