مكون كيميائي لأنابيب لفائف الفولاذ المقاوم للصدأ 304، يحتوي هيكل النطاق الخارجي SPACA6 على فصيلة فائقة محفوظة من البروتينات المرتبطة باندماج الأمشاج.

شكرا لكم لزيارة Nature.com.أنت تستخدم إصدار متصفح مع دعم محدود لـ CSS.للحصول على أفضل تجربة، نوصي باستخدام متصفح محدث (أو تعطيل وضع التوافق في Internet Explorer).بالإضافة إلى ذلك، ولضمان الدعم المستمر، نعرض الموقع بدون أنماط وجافا سكريبت.
أشرطة التمرير تعرض ثلاث مقالات لكل شريحة.استخدم زري الرجوع والتالي للتنقل عبر الشرائح، أو أزرار التحكم في الشرائح الموجودة في النهاية للتنقل خلال كل شريحة.

SPACA6 هو بروتين سطحي يتم التعبير عنه بالحيوانات المنوية وهو أمر بالغ الأهمية لاندماج الأمشاج أثناء التكاثر الجنسي للثدييات.على الرغم من هذا الدور الأساسي، فإن الوظيفة المحددة لـ SPACA6 غير مفهومة جيدًا.نوضح التركيب البلوري للمجال خارج الخلية لـ SPACA6 بدقة 2.2 Å، مما يكشف عن بروتين ثنائي المجال يتكون من حزمة رباعية الجدائل وشطائر Ig تشبه روابط شبه مرنة.يشبه هذا الهيكل IZUMO1، وهو بروتين آخر مرتبط بدمج الأمشاج، مما يجعل SPACA6 وIZUMO1 أعضاء مؤسسين في فصيلة البروتينات المرتبطة بالتخصيب المشار إليها هنا باسم عائلات IST الفائقة.يتم تعريف عائلة IST الفائقة من الناحية الهيكلية من خلال حزمة الحلزون الأربعة الملتوية وزوج من زخارف CXXC المرتبطة بالكبريتيد.حدد بحث AlphaFold القائم على البنية للبروتين البشري أعضاء بروتين إضافيين في هذه العائلة الفائقة؛والجدير بالذكر أن العديد من هذه البروتينات تشارك في اندماج الأمشاج.يوفر هيكل SPACA6 وعلاقته بالأعضاء الآخرين في عائلة IST الفائقة الحلقة المفقودة في معرفتنا عن اندماج الأمشاج في الثدييات.
تبدأ حياة كل إنسان بأمشاجين منفصلين: الحيوان المنوي للأب وبويضة الأم.هذه الحيوانات المنوية هي الفائزة في عملية اختيار مكثفة تمر خلالها ملايين الخلايا المنوية عبر الجهاز التناسلي الأنثوي، وتتغلب على العقبات المختلفة 1 وتخضع للقدرة، مما يعزز حركتها وعملية المكونات السطحية 2،3،4.حتى لو وجدت الحيوانات المنوية والبويضة بعضها البعض، فإن العملية لم تنته بعد.البويضة محاطة بطبقة من الخلايا الركامية وحاجز من البروتين السكري يسمى المنطقة الشفافة، والتي يجب أن تمر من خلالها الحيوانات المنوية لدخول البويضة.تستخدم الحيوانات المنوية مزيجًا من جزيئات الالتصاق السطحية والإنزيمات المفرزة والمرتبطة بالغشاء للتغلب على هذه الحواجز النهائية.يتم تخزين هذه الجزيئات والإنزيمات بشكل أساسي في الغشاء الداخلي والمصفوفة الطرفية ويتم اكتشافها عندما يتم تحلل الغشاء الخارجي للحيوانات المنوية أثناء تفاعل الجسيم الطرفي6.الخطوة الأخيرة في هذه الرحلة المكثفة هي حدث اندماج الحيوان المنوي والبويضة، حيث تقوم الخليتان بدمج أغشيةهما لتصبح كائنًا ثنائي الصيغة الصبغية 7 .على الرغم من أن هذه العملية تعتبر رائدة في التكاثر البشري، إلا أن التفاعلات الجزيئية الضرورية غير مفهومة جيدًا.
بالإضافة إلى تخصيب الأمشاج، تمت دراسة كيمياء اندماج طبقتين دهنيتين على نطاق واسع.بشكل عام، يعد اندماج الأغشية عملية غير مواتية طاقيًا تتطلب خضوع محفز البروتين لتغيير في البنية الهيكلية، مما يؤدي إلى تقريب الأغشية من بعضها البعض، مما يؤدي إلى كسر استمراريتها والتسبب في الاندماج 8،9.تُعرف محفزات البروتين هذه باسم المصهرات وقد تم العثور عليها في عدد لا يحصى من أنظمة الاندماج.وهي مطلوبة للدخول الفيروسي إلى الخلايا المضيفة (على سبيل المثال، gp160 في فيروس نقص المناعة البشرية -1، والارتفاع في فيروسات كورونا، والهيماجلوتينين في فيروسات الأنفلونزا) 10،11،12 المشيمة (سينسيتين) 13،14،15 واندماج الأمشاج في حقيقيات النوى السفلية ( HAP2/GCS1 في النباتات والطلائعيات والمفصليات) 16،17،18،19.لم يتم بعد اكتشاف المركبات المصهرية للأمشاج البشرية، على الرغم من أن العديد من البروتينات أثبتت أنها مهمة لربط الأمشاج واندماجها.كان بروتين CD9 المعبر عن البويضة، وهو بروتين عبر الغشاء مطلوب لدمج الأمشاج الفأرية والأمشاج البشرية، هو أول بروتين تم اكتشافه 21،22،23.على الرغم من أن وظيفتها الدقيقة لا تزال غير واضحة، إلا أنه من المحتمل أن يكون لها دور في الالتصاق، وبنية بؤر الالتصاق على زغيبات البيض، و/أو التوطين الصحيح لبروتينات سطح البويضة.البروتينان الأكثر شيوعًا اللذان يعتبران حاسمين في اندماج الأمشاج هما بروتين الحيوانات المنوية IZUMO127 وبروتين البويضات JUNO28، ويعد ارتباطهما المتبادل خطوة مهمة في التعرف على الأمشاج والالتصاق قبل الاندماج.إن ذكور الفئران المعطلة Izumo1 وإناث الفئران المعطلة Juno عقيمة تمامًا، وفي هذه النماذج تدخل الحيوانات المنوية إلى الفضاء المحيط بالمح ولكن الأمشاج لا تندمج.وبالمثل، انخفض الالتقاء عندما عولجت الأمشاج بالأجسام المضادة لـ IZUMO1 أو JUNO27,29 في تجارب التخصيب البشري في المختبر.
في الآونة الأخيرة، تم اكتشاف مجموعة مكتشفة حديثًا من البروتينات التي يتم التعبير عنها بالحيوانات المنوية والمشابهة ظاهريًا لـ IZUMO1 وJUNO20،30،31،32،33،34،35.تم تحديد البروتين المرتبط بغشاء الحيوانات المنوية 6 (SPACA6) باعتباره ضروريًا للتخصيب في دراسة طفرات الفئران واسعة النطاق.يؤدي إدخال الجين المحور في جين Spaca6 إلى إنتاج حيوانات منوية غير قابلة للانصهار، على الرغم من أن هذه الحيوانات المنوية تتسلل إلى الحيز المحيط بالمح 36 .وأكدت دراسات خروج المغلوب اللاحقة في الفئران أن Spaca6 مطلوب لاندماج الأمشاج 30،32.يتم التعبير عن SPACA6 بشكل حصري تقريبًا في الخصيتين وله نمط توطين مشابه لنمط IZUMO1، وبالتحديد داخل الطبقة الداخلية للحيوانات المنوية قبل التفاعل الجسيمي، ثم يهاجر إلى المنطقة الاستوائية بعد التفاعل الجسيمي 30،32.توجد متجانسات Spaca6 في مجموعة متنوعة من الثدييات وحقيقيات النوى الأخرى 30 وقد تم إثبات أهميتها لاندماج الأمشاج البشرية من خلال تثبيط الإخصاب البشري في المختبر عن طريق مقاومة SPACA6 30.على عكس IZUMO1 وJUNO، تظل تفاصيل هيكل SPACA6 وتفاعلاته ووظيفته غير واضحة.
لفهم العملية الأساسية الكامنة وراء اندماج الحيوانات المنوية البشرية والبويضات بشكل أفضل، والتي ستمكننا من إبلاغ التطورات المستقبلية في تنظيم الأسرة وعلاج الخصوبة، أجرينا دراسات هيكلية وكيميائية حيوية لـ SPACA6.يُظهر التركيب البلوري للمجال خارج الخلية لـ SPACA6 حزمة رباعية حلزونية (4HB) ومجال يشبه الجلوبيولين المناعي (يشبه Ig) متصل بمناطق شبه مرنة.كما كان متوقعًا في الدراسات السابقة، 7،32،37، يشبه هيكل مجال SPACA6 هيكل IZUMO1 البشري، ويشترك البروتينان في شكل غير عادي: 4HB مع سطح حلزوني مثلث وزوج من أشكال CXXC المرتبطة ثاني كبريتيد.نقترح أن يحدد كل من IZUMO1 وSPCA6 الآن مجموعة كبيرة من البروتينات المرتبطة بدمج الأمشاج والمرتبطة هيكليًا.باستخدام الميزات الفريدة لهذه العائلة الفائقة، أجرينا بحثًا شاملاً عن البروتين البشري الهيكلي AlphaFold، وحددنا أعضاء إضافيين من هذه العائلة الفائقة، بما في ذلك العديد من الأعضاء المشاركين في اندماج الأمشاج و/أو الإخصاب.يبدو الآن أن هناك طية هيكلية مشتركة وفصيلة فائقة من البروتينات المرتبطة باندماج الأمشاج، ويوفر هيكلنا خريطة جزيئية لهذا الجانب المهم من آلية اندماج الأمشاج البشرية.
SPACA6 عبارة عن بروتين غشائي أحادي المرور يحتوي على جليكان مرتبط بـ N وستة روابط ثاني كبريتيد مفترضة (الشكلان S1a وS2).عبرنا عن المجال خارج الخلية لـ SPACA6 البشري (البقايا 27-246) في خلايا ذبابة الفاكهة S2 وقمنا بتنقية البروتين باستخدام تقارب النيكل وتبادل الكاتيونات وكروماتوجرافيا استبعاد الحجم (الشكل S1b).يعتبر المجال الخارجي SPACA6 المنقى مستقرًا ومتجانسًا للغاية.كشف التحليل باستخدام كروماتوجرافيا استبعاد الحجم مع تشتت الضوء متعدد الأضلاع (SEC-MALS) عن قمة واحدة بوزن جزيئي محسوب قدره 26.2 ± 0.5 كيلو دالتون (الشكل S1c).وهذا يتوافق مع حجم النطاق الخارجي الأحادي SPACA6، مما يشير إلى أن عملية احتكار القلة لم تحدث أثناء التنقية.بالإضافة إلى ذلك، كشف التحليل الطيفي مزدوج اللون الدائري (CD) عن بنية α / β مختلطة مع نقطة انصهار تبلغ 51.3 درجة مئوية (الشكل S1d، e).كشف تفكك أطياف القرص المضغوط عن 38.6٪ حلزونيًا α و 15.8٪ عناصر تقطعت بهم السبل (الشكل S1d).
تمت بلورة المجال الخارجي SPACA6 باستخدام بذر المصفوفة العشوائية مما أدى إلى مجموعة بيانات بدقة 2.2 Å (الجدول 1 والشكل S3).باستخدام مزيج من الاستبدال الجزيئي القائم على الأجزاء وبيانات مراحل SAD مع التعرض للبروميد لتحديد الهيكل (الجدول 1 والشكل S4)، يتكون النموذج النهائي المكرر من المخلفات 27-246.في الوقت الذي تم فيه تحديد البنية، لم تكن هناك هياكل تجريبية أو هياكل AlphaFold متاحة.يبلغ قياس المجال الخارجي SPACA6 20 Å × 20 Å × 85 Å، ويتكون من سبعة حلزونات وتسعة خيوط، وله طية ثلاثية ممدودة مثبتة بستة روابط ثاني كبريتيد (الشكل 1 أ، ب).تشير كثافة الإلكترون الضعيفة في نهاية السلسلة الجانبية Asn243 إلى أن هذه البقايا عبارة عن غليكوزيل مرتبط بـ N.يتكون الهيكل من مجالين: حزمة حلزونية رباعية الطرف N (4HB) ومجال يشبه Ig للطرف C مع منطقة مفصلية وسيطة بينهما (الشكل 1 ج).
هيكل المجال خارج الخلية لـ SPACA6.رسم تخطيطي للمجال خارج الخلية لـ SPACA6، لون السلسلة من الطرف N إلى الطرف C من الأزرق الداكن إلى الأحمر الداكن.يتم تسليط الضوء على السيستين المشاركة في روابط ثاني كبريتيد في اللون الأرجواني.ب طوبولوجيا المجال خارج الخلية لـ SPACA6.استخدم نفس نظام الألوان كما في الشكل 1أ.ج SPACA6 المجال خارج الخلية.يتم تلوين المخططات الشريطية للمجال 4HB والمفصلة والمشابهة لـ Ig باللون البرتقالي والأخضر والأزرق على التوالي.لا يتم رسم الطبقات على نطاق واسع.
يشتمل مجال 4HB الخاص بـ SPACA6 على أربع حلزونات رئيسية (الحلزونات 1-4)، والتي يتم ترتيبها على شكل حلزون حلزوني (الشكل 2 أ)، بالتناوب بين التفاعلات المضادة المتوازية والمتوازية (الشكل 2 ب).يتم وضع حلزون صغير إضافي أحادي الدوران (الحلزون 1 ′) بشكل عمودي على الحزمة، مما يشكل مثلثًا به الحلزونات 1 و 2. هذا المثلث مشوه قليلاً في التعبئة الملتوية الحلزونية للتعبئة الكثيفة نسبيًا للحلزونات 3 و 4 ( الشكل 2 أ).
مخطط شريطي للمحطة 4HB N.ب منظر علوي لحزمة مكونة من أربع حلزونات، تم تمييز كل حلزون باللون الأزرق الداكن عند الطرف N والأحمر الداكن عند الطرف C.c رسم تخطيطي للعجلة الحلزونية من أعلى إلى أسفل لـ 4HB، مع إظهار كل بقايا كدائرة تحمل رمز حمض أميني مكون من حرف واحد؛يتم ترقيم الأحماض الأمينية الأربعة الموجودة أعلى العجلة فقط.يتم تلوين البقايا غير القطبية باللون الأصفر، والمخلفات القطبية غير المشحونة باللون الأخضر، والمخلفات الموجبة الشحنة باللون الأزرق، والمخلفات السالبة باللون الأحمر.د وجوه مثلثة للمجال 4HB، مع 4HBs باللون البرتقالي والمفصلات باللون الأخضر.يظهر كلا المدخلين روابط ثاني كبريتيد على شكل قضيب.
يتركز 4HB على قلب داخلي كاره للماء يتكون أساسًا من بقايا أليفاتية وعطرية (الشكل 2 ج).يحتوي القلب على رابطة ثاني كبريتيد بين Cys41 وCys55 التي تربط الحلزونات 1 و2 معًا في مثلث مرتفع مرتفع (الشكل 2 د).تم تشكيل رابطتين إضافيتين من ثاني كبريتيد بين نموذج CXXC في اللولب 1 ′ وعزر CXXC آخر تم العثور عليه عند طرف دبوس الشعر β في منطقة المفصلة (الشكل 2 د).توجد بقايا أرجينين محافظة ذات وظيفة غير معروفة (Arg37) داخل مثلث مجوف مكون من حلزونات 1 ′ و1 و2. تتفاعل ذرات الكربون الأليفاتية Cβ وCγ وCδ Arg37 مع النواة الكارهة للماء، وتتحرك مجموعات الجوانيدين الخاصة بها بشكل دوري بين الحلزونات 1 ′ و 1 عبر التفاعلات بين العمود الفقري Thr32 والسلسلة الجانبية (الشكل S5a، b).يمتد Tyr34 إلى التجويف تاركًا تجاويف صغيرة يمكن من خلالها أن يتفاعل Arg37 مع المذيب.
نطاقات β-sandwich التي تشبه Ig هي فصيلة كبيرة من البروتينات التي تشترك في السمة المشتركة لاثنين أو أكثر من صفائح amphipathic متعددة الجدائل التي تتفاعل عبر نواة كارهة للماء 39. المجال Ig-like لـ C-terminal في SPACA6 له نفس النمط ويتكون من طبقتين (الشكل S6a).الورقة 1 عبارة عن ورقة β مكونة من أربعة فروع (خيوط D وF وH وI) حيث تشكل الخيوط F وH وI ترتيبًا غير متوازي، وتتخذ الخيوط I وD تفاعلًا متوازيًا.الجدول 2 عبارة عن ورقة بيتا صغيرة مزدوجة الجديلة ومضادة للتوازي (الفرعان E وG).وقد لوحظ وجود رابطة ثاني كبريتيد داخلية بين الطرف C للسلسلة E ومركز السلسلة H (Cys170-Cys226) (الشكل S6b).تشبه رابطة ثاني كبريتيد رابطة ثاني كبريتيد في مجال β-sandwich من الغلوبولين المناعي 40،41.
تلتف الصفائح المكونة من أربعة أشرطة على طولها بالكامل، وتشكل حواف غير متماثلة تختلف في الشكل والكهرباء الساكنة.الحافة الرقيقة عبارة عن سطح بيئي مسطح كاره للماء يبرز مقارنة بالأسطح المتبقية غير المستوية والمتنوعة كهروستاتيكيًا في SPACA6 (الشكل S6b، c).تحيط هالة من مجموعات الكربونيل / الأمينية العمود الفقري المكشوفة والسلاسل الجانبية القطبية بالسطح الكاره للماء (الشكل S6c).يتم تغطية الهامش الأوسع بجزء حلزوني متوج يحجب الجزء الطرفي N من النواة الكارهة للماء ويشكل ثلاث روابط هيدروجينية مع المجموعة القطبية المفتوحة للعمود الفقري لسلسلة F (الشكل S6d).يشكل الجزء الطرفي C من هذه الحافة جيبًا كبيرًا ذو نواة مكشوفة جزئيًا كارهة للماء.الجيب محاط بشحنات موجبة بسبب ثلاث مجموعات من بقايا الأرجينين المزدوجة (Arg162-Arg221 وArg201-Arg205 وArg212-Arg214) والهستيدين المركزي (His220) (الشكل S6e).
المنطقة المفصلية عبارة عن جزء قصير بين المجال الحلزوني والمجال الشبيه بـ Ig، وتتكون من طبقة بيتا واحدة ثلاثية الجدائل متقابلة (الخيوط A وB وC)، وحلزون صغير 310، والعديد من المقاطع الحلزونية العشوائية الطويلة.(الشكل S7).يبدو أن شبكة من الاتصالات التساهمية والكهروستاتيكية في منطقة المفصلة تعمل على تثبيت الاتجاه بين 4HB والمجال الشبيه بـ Ig.يمكن تقسيم الشبكة إلى ثلاثة أجزاء.يتضمن الجزء الأول نموذجين CXXC (27CXXC30 و139CXXC142) يشكلان زوجًا من روابط ثاني كبريتيد بين دبوس الشعر β في المفصلة والحلزون 1′ في 4HB.يتضمن الجزء الثاني التفاعلات الكهروستاتيكية بين المجال الشبيه بـ Ig والمفصلة.يشكل Glu132 الموجود في المفصلة جسرًا ملحيًا مع Arg233 في المجال الشبيه بـ Ig وArg135 في المفصلة.الجزء الثالث يتضمن رابطة تساهمية بين المجال Ig-like والمنطقة المفصلية.تربط رابطتان ثاني كبريتيد (Cys124-Cys147 وCys128-Cys153) الحلقة المفصلية برابط يتم تثبيته بواسطة التفاعلات الكهروستاتيكية بين Gln131 والمجموعة الوظيفية الأساسية، مما يسمح بالوصول إلى أول مجال يشبه Ig.سلسلة.
واستخدمت بنية المجال الخارجي SPACA6 والهياكل الفردية للنطاقات 4HB وIg للبحث عن سجلات مماثلة هيكليا في قواعد بيانات البروتين 42.لقد حددنا التطابقات ذات درجات Dali Z العالية، والانحرافات المعيارية الصغيرة، ودرجات LALI الكبيرة (الأخير هو عدد المخلفات المكافئة هيكلياً).في حين أن أول 10 نتائج من البحث الكامل للمجال الخارجي (الجدول S1) كانت لها درجة Z مقبولة تبلغ> 842، فإن البحث عن مجال 4HB أو Ig-like وحده أظهر أن معظم هذه الزيارات تتوافق مع شطائر β فقط.طية موجودة في كل مكان في العديد من البروتينات.جميع عمليات البحث الثلاثة في دالي أعادت نتيجة واحدة فقط: IZUMO1.
لقد اقترح منذ فترة طويلة أن SPACA6 و IZUMO1 يشتركان في أوجه التشابه الهيكلية .على الرغم من أن المجالات الخارجية لهذين البروتينين المرتبطين بدمج الأمشاج تشترك في هوية تسلسل بنسبة 21٪ فقط (الشكل S8a)، إلا أن الأدلة المعقدة، بما في ذلك نمط رابطة ثاني كبريتيد محفوظ ومجال يشبه Ig للمحطة C المتوقعة في SPACA6، سمحت بمحاولات مبكرة لبناء نموذج التماثل للفأرة SPACA6 باستخدام IZUMO1 كقالب .يؤكد هيكلنا هذه التوقعات ويظهر الدرجة الحقيقية للتشابه.في الواقع ، تشترك هياكل SPACA6 و IZUMO137،43،44 في نفس البنية ذات المجالين (الشكل S8b) مع مجالات ساندويتش 4HB و Ig مماثلة متصلة بواسطة منطقة مفصلية (الشكل S8c).
IZUMO1 وSPACA6 4HB لديهما اختلافات مشتركة عن الحزم الحلزونية التقليدية.تحتوي 4HBs النموذجية، مثل تلك الموجودة في مجمعات بروتين SNARE المشاركة في الاندماج الاندوسومي 45،46، على حلزونات متباعدة بشكل متساوٍ تحافظ على انحناء ثابت حول محور مركزي 47. في المقابل، تم تشويه المجالات الحلزونية في كل من IZUMO1 وSPCA6، مع انحناء متغير و التعبئة غير المستوية (الشكل S8d).تم الاحتفاظ بالالتواء، الذي ربما يكون ناجمًا عن المثلث الذي شكلته الحلزونات 1 ′ و1 و2، في IZUMO1 وSPCA6 وتم تثبيته بواسطة نفس نموذج CXXC على الحلزون 1′.ومع ذلك، فإن رابطة ثاني كبريتيد الإضافية الموجودة في SPACA6 (Cys41 وCys55 التي تربط الحلزونات 1 و2 أعلاه تساهميًا) تخلق قمة أكثر وضوحًا عند قمة المثلث، مما يجعل SPACA6 أكثر ملتوية من IZUMO1، مع مثلثات تجويف أكثر وضوحًا.بالإضافة إلى ذلك، يفتقر IZUMO1 إلى Arg37 الذي تمت ملاحظته في وسط هذا التجويف في SPACA6.في المقابل، يحتوي IZUMO1 على نواة أكثر نموذجية كارهة للماء من المخلفات الأليفاتية والعطرية.
يحتوي IZUMO1 على مجال يشبه Ig يتكون من ورقة β-43 مزدوجة الجديلة وخمسة تقطعت بهم السبل.تحل السلسلة الإضافية في IZUMO1 محل الملف في SPACA6، الذي يتفاعل مع السلسلة F للحد من روابط الهيدروجين الأساسية في السلسلة.نقطة المقارنة المثيرة للاهتمام هي الشحنة السطحية المتوقعة للنطاقات المشابهة لـ Ig للبروتينين.سطح IZUMO1 مشحون بشكل سلبي أكثر من سطح SPACA6.توجد رسوم إضافية بالقرب من الطرف C الذي يواجه غشاء الحيوانات المنوية.في SPACA6، كانت نفس المناطق أكثر حيادية أو موجبة الشحنة (الشكل S8e).على سبيل المثال، السطح الكاره للماء (الحواف الرقيقة) والحفر المشحونة إيجابيًا (الحواف الأوسع) في SPACA6 مشحونة سالبًا في IZUMO1.
على الرغم من الحفاظ على العلاقة وعناصر البنية الثانوية بين IZUMO1 وSPCA6 بشكل جيد، إلا أن المحاذاة الهيكلية للنطاقات المشابهة لـ Ig أظهرت أن المجالين يختلفان في اتجاههما العام بالنسبة لبعضهما البعض (الشكل S9).الحزمة الحلزونية لـ IZUMO1 منحنية حول ساندويتش β، مما يخلق شكل "البوميرانج" الموصوف مسبقًا عند حوالي 50 درجة من المحور المركزي.في المقابل، كان الشعاع الحلزوني في SPACA6 مائلًا بحوالي 10 درجات في الاتجاه المعاكس.من المحتمل أن تكون الاختلافات في هذه التوجهات بسبب الاختلافات في منطقة المفصلة.على مستوى التسلسل الأولي، يتشارك IZUMO1 وSPACA6 في القليل من التشابه في التسلسل عند المفصلة، ​​باستثناء بقايا حمض السيستين والجليسين وحمض الأسبارتيك.ونتيجة لذلك، فإن الروابط الهيدروجينية والشبكات الكهروستاتيكية مختلفة تمامًا.تتم مشاركة عناصر البنية الثانوية المكونة من صفائح بيتا بواسطة IZUMO1 وSPACA6، على الرغم من أن السلاسل في IZUMO1 أطول بكثير وأن الحلزون 310 (الحلزون 5) فريد لـ SPACA6.تؤدي هذه الاختلافات إلى اتجاهات مجال مختلفة لاثنين من البروتينات المتشابهة.
كشف بحث خادم Dali الخاص بنا أن SPACA6 وIZUMO1 هما البنيتان الوحيدتان المحددتان تجريبيًا والمخزنتان في قاعدة بيانات البروتين والتي تحتوي على طية 4HB المحددة (الجدول S1).في الآونة الأخيرة، قامت شركة DeepMind (Alphabet/Google) بتطوير AlphaFold، وهو نظام قائم على الشبكة العصبية يمكنه التنبؤ بدقة بالهياكل ثلاثية الأبعاد للبروتينات من التسلسلات الأولية.بعد وقت قصير من حل بنية SPACA6، تم إصدار قاعدة بيانات AlphaFold، مما يوفر نماذج بنية تنبؤية تغطي 98.5% من جميع البروتينات في البروتين البشري.باستخدام بنية SPACA6 التي تم حلها كنموذج بحث، حدد بحث التماثل الهيكلي للنموذج الموجود في البروتين البشري AlphaFold المرشحين الذين لديهم أوجه تشابه هيكلية محتملة مع SPACA6 وIZUMO1.نظرًا للدقة المذهلة لـ AlphaFold في التنبؤ بـ SPACA6 (الشكل S10a) - خاصةً المجال الخارجي 1.1 Å مقارنة بالهيكل الذي تم حله لدينا (الشكل S10b) - يمكننا أن نكون واثقين من أن مطابقات SPACA6 المحددة من المرجح أن تكون دقيقة.
في السابق، بحثت PSI-BLAST عن مجموعة IZUMO1 مع ثلاثة بروتينات أخرى مرتبطة بالحيوانات المنوية: IZUMO2، وIZUMO3، وIZUMO450.توقع AlphaFold أن بروتينات عائلة IZUMO هذه تنطوى في مجال 4HB بنفس نمط رابطة ثاني كبريتيد مثل IZUMO1 (الشكلان 3 أ وS11)، على الرغم من أنها تفتقر إلى مجال يشبه Ig.من المفترض أن IZUMO2 وIZUMO3 عبارة عن بروتينات غشائية أحادية الجانب تشبه IZUMO1، بينما يبدو أن IZUMO4 مُفرز.لم يتم تحديد وظائف بروتينات IZUMO 2 و3 و4 في اندماج الأمشاج.من المعروف أن IZUMO3 يلعب دورًا في التكاثر الحيوي للجسيم الطرفي أثناء تطور الحيوانات المنوية51 وقد وجد أن بروتين IZUMO يشكل مركبًا50.يشير الحفاظ على بروتينات IZUMO في الثدييات والزواحف والبرمائيات إلى أن وظيفتها المحتملة تتوافق مع وظيفة البروتينات المعروفة الأخرى المرتبطة بدمج الأمشاج، مثل DCST1/2، وSOF1، وFIMP.
رسم تخطيطي لهندسة المجال لعائلة IST الفائقة، مع تمييز النطاقات 4HB والمفصلة والمشابهة لـ Ig باللون البرتقالي والأخضر والأزرق على التوالي.يحتوي IZUMO4 على منطقة طرفية C فريدة تبدو سوداء.تظهر روابط ثاني كبريتيد المؤكدة والمفترضة بخطوط صلبة ومنقطة، على التوالي.ب IZUMO1 (PDB: 5F4E)، SPACA6، IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1)، IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1)، IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1)، وTMEM95 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) يتم عرضها في نفس نطاق الألوان مثل اللوحة A. تظهر روابط ثنائي الكبريتيد باللون الأرجواني.لا تظهر حلزونات الغشاء TMEM95 وIZUMO2 وIZUMO3.
على عكس بروتين IZUMO، يعتقد أن بروتينات SPACA الأخرى (على سبيل المثال، SPACA1، SPACA3، SPACA4، SPACA5، و SPACA9) مختلفة هيكليًا عن SPACA6 (الشكل S12).فقط SPACA9 لديه 4HB، ولكن من غير المتوقع أن يكون له نفس الاتجاه المتوازي ومضاد التوازي أو نفس رابطة ثاني كبريتيد مثل SPACA6.فقط SPACA1 لديه مجال مشابه لـ Ig.يتوقع AlphaFold أن SPACA3 وSPACA4 وSPACA5 لها بنية مختلفة تمامًا عن SPACA6.ومن المثير للاهتمام، أنه من المعروف أيضًا أن SPACA4 يلعب دورًا في الإخصاب، ولكن إلى حد أكبر من SPACA6، وبدلاً من ذلك يسهل التفاعل بين الحيوانات المنوية ومنطقة البويضات الشفافة 52.
عثر بحث AlphaFold الذي أجريناه على تطابق آخر لـ IZUMO1 وSPCA6 4HB، TMEM95.TMEM95، وهو بروتين غشائي واحد خاص بالحيوانات المنوية، يجعل الفئران الذكور عقيمة عند استئصالها.تتمتع الحيوانات المنوية التي تفتقر إلى TMEM95 بتشكل طبيعي وحركة وقدرة على اختراق المنطقة الشفافة والارتباط بغشاء البويضة، لكنها لا تستطيع الاندماج مع غشاء البويضة.أظهرت الدراسات السابقة أن TMEM95 يشترك في أوجه التشابه الهيكلية مع IZUMO133.في الواقع، أكد نموذج AlphaFold أن TMEM95 هو 4HB مع نفس زوج نماذج CXXC مثل IZUMO1 وSPCA6 ونفس رابطة ثاني كبريتيد الإضافية بين الحلزونات 1 و2 الموجودة في SPACA6 (الشكل 3 أ وS11).على الرغم من أن TMEM95 يفتقر إلى مجال يشبه Ig، إلا أنه يحتوي على منطقة ذات نمط رابطة ثاني كبريتيد مشابه للمناطق المفصلية SPACA6 وIZUMO1 (الشكل 3 ب).في وقت نشر هذه المخطوطة، أبلغ خادم الطباعة المسبقة عن بنية TMEM95، مما يؤكد نتيجة AlphaFold53.يشبه TMEM95 إلى حد كبير SPACA6 وIZUMO1 ويتم حفظه تطوريًا بالفعل في البرمائيات (الشكل 4 وS13).
استخدم بحث PSI-BLAST قواعد بيانات NCBI SPACA6 وIZUMO1-4 وTMEM95 وDCST1 وDCST2 وFIMP وSOF1 لتحديد موضع هذه التسلسلات في شجرة الحياة.لا تظهر المسافات بين النقاط الفرعية على نطاق واسع.
يشير التشابه الهيكلي الإجمالي المذهل بين SPACA6 وIZUMO1 إلى أنهما عضوان مؤسسان في فصيلة هيكلية فائقة محفوظة تتضمن بروتينات TMEM95 وIZUMO 2 و3 و4.الأعضاء المعروفون: IZUMO1، وSPACA6، وTMEM95.نظرًا لأن عددًا قليلاً فقط من الأعضاء يمتلكون نطاقات تشبه Ig، فإن السمة المميزة لعائلة IST الفائقة هي نطاق 4HB، الذي يحتوي على ميزات فريدة مشتركة بين جميع هذه البروتينات: 1) 4HB ملفوف مع حلزونات مرتبة في تناوب مضاد/متوازي (الشكل 1). (الشكل 5 أ)، 2) الحزمة لها وجه مثلث يتكون من حلزونين داخل الحزمة وحلزون رأسي ثالث (الشكل. المنطقة الرئيسية (الشكل 5 ج). من المعروف أن نموذج CXXC، الموجود في البروتينات الشبيهة بالثيوريدوكسين، يعمل كما جهاز استشعار الأكسدة والاختزال 54،55،56، في حين يمكن أن تترافق عزر في أفراد الأسرة IST مع ايزوميرات ثاني كبريتيد البروتين مثل ERp57 في اندماج الأمشاج وترتبط الأدوار 57،58.
يتم تعريف أعضاء عائلة IST الفائقة من خلال ثلاث سمات مميزة للمجال 4HB: أربع حلزونات تتناوب بين الاتجاه المتوازي والمضاد للتوازي، ووجوه الحزمة الحلزونية المثلثة، وشكل مزدوج ca CXXC يتكون بين جزيئات صغيرة.) الحلزون الطرفي N (برتقالي) ومنطقة المفصلة β-دبوس الشعر (أخضر).
نظرًا للتشابه بين SPACA6 وIZUMO1، تم اختبار قدرة الأول على الارتباط بـ IZUMO1 أو JUNO.يعد قياس تداخل الطبقة البيولوجية (BLI) طريقة ربط قائمة على الحركية تم استخدامها سابقًا لقياس التفاعل بين IZUMO1 وJUNO.بعد حضانة المستشعر المسمى البيوتين مع IZUMO1 كطعم بتركيز عالٍ من تحليل JUNO، تم اكتشاف إشارة قوية (الشكل S14a)، تشير إلى تغير ناجم عن الارتباط في سمك المادة الحيوية المرتبطة بطرف المستشعر.إشارات مماثلة (على سبيل المثال، JUNO مقترنة بالمستشعر كطعم ضد تحليل IZUMO1) (الشكل S14b).لم يتم اكتشاف أي إشارة عند استخدام SPACA6 كحليلة ضد IZUMO1 المرتبط بالمستشعر أو JUNO المرتبط بالمستشعر (الشكل S14a، b).يشير غياب هذه الإشارة إلى أن المجال خارج الخلية لـ SPACA6 لا يتفاعل مع المجال خارج الخلية لـ IZUMO1 أو JUNO.
نظرًا لأن اختبار BLI يعتمد على التحلل الحيوي لبقايا الليسين الحرة على بروتين الطعم، فإن هذا التعديل يمكن أن يمنع الارتباط إذا كانت بقايا الليسين متورطة في التفاعل.بالإضافة إلى ذلك، فإن اتجاه الارتباط بالنسبة للمستشعر يمكن أن يخلق عوائق جامدة، لذلك تم إجراء فحوصات منسدلة تقليدية أيضًا على المجالات الخارجية SPACA6 وIZUMO1 وJUNO المؤتلفة.على الرغم من ذلك، لم يترسب SPACA6 مع IZUMO1 ذو العلامات أو JUNO ذو العلامات (الشكل S14c، d)، مما يشير إلى عدم وجود تفاعل يتوافق مع ذلك الذي لوحظ في تجارب BLI.كعنصر تحكم إيجابي، أكدنا تفاعل JUNO مع المسمى IZUMO1 (الشكلان S14e وS15).
على الرغم من التشابه الهيكلي بين SPACA6 وIZUMO1، فإن عدم قدرة SPACA6 على ربط JUNO ليس مفاجئًا.يحتوي سطح IZUMO1 البشري على أكثر من 20 بقايا تتفاعل مع JUNO، بما في ذلك بقايا من كل منطقة من المناطق الثلاث (على الرغم من أن معظمها يقع في منطقة المفصلة) (الشكل S14f).من هذه البقايا، يتم حفظ واحد فقط في SPACA6 (Glu70).في حين احتفظت العديد من بدائل البقايا بخصائصها الكيميائية الحيوية الأصلية، تم استبدال بقايا Arg160 الأساسية في IZUMO1 بـ Asp148 المشحونة سالبًا في SPACA6؛أظهرت الدراسات السابقة أن طفرة Arg160Glu في IZUMO1 تلغي الارتباط بـ JUNO43 بشكل كامل تقريبًا.بالإضافة إلى ذلك، أدى الاختلاف في اتجاه المجال بين IZUMO1 وSPCA6 إلى زيادة كبيرة في مساحة سطح موقع ربط JUNO للمنطقة المكافئة على SPACA6 (الشكل S14g).
على الرغم من الحاجة المعروفة لـ SPACA6 لدمج الأمشاج وتشابهه مع IZUMO1، لا يبدو أن SPACA6 لديه وظيفة ربط JUNO مكافئة.لذلك، سعينا إلى الجمع بين بياناتنا الهيكلية والأدلة ذات الأهمية التي توفرها البيولوجيا التطورية.تُظهر محاذاة التسلسل لمتجانسات SPACA6 الحفاظ على البنية المشتركة خارج الثدييات.على سبيل المثال، توجد بقايا السيستين حتى في البرمائيات ذات الصلة البعيدة (الشكل 6 أ).باستخدام خادم ConSurf، تم تعيين بيانات الاحتفاظ بمحاذاة التسلسل المتعددة المكونة من 66 تسلسلًا على سطح SPACA6.يمكن أن يُظهر هذا النوع من التحليل البقايا التي تم حفظها أثناء تطور البروتين ويمكن أن يشير إلى المناطق السطحية التي تلعب دورًا في الوظيفة.
محاذاة تسلسلية للنطاقات الخارجية SPACA6 من 12 نوعًا مختلفًا تم إعدادها باستخدام CLUSTAL OMEGA.ووفقا لتحليل ConSurf، تم تمييز المواقف الأكثر تحفظا باللون الأزرق.يتم تمييز بقايا السيستين باللون الأحمر.تظهر حدود المجال وعناصر البنية الثانوية في الجزء العلوي من المحاذاة، حيث تشير الأسهم إلى خيوط β وتشير الموجات إلى الحلزونات.معرفات الوصول إلى NCBI التي تحتوي على التسلسلات هي: الإنسان (Homo sapiens، NP_001303901)، الماندريل (Mandrilus leucophaeus، XP_011821277)، القرد الكبوشي (Cebus mimic، XP_017359366)، الحصان (Equus caballus، XP_023506102)، الحوت القاتل (Orcinus orca3_23 XP_0) 32_034) .)، الأغنام (Ovis aries، XP_014955560)، الفيل (Loxodonta africana، XP_010585293)، الكلب (Canis lupus Familyis، XP_025277208)، الفأر (Mus musculus، NP_001156381)، شيطان تسمانيا (Sarcophilus harrisii، XP_03611، XP_0318)، خلد الماء , 8) و 61_89 والضفدع (Bufo bufo، XP_040282113).يعتمد الترقيم على أمر الإنسان.(ب) التمثيل السطحي لبنية SPACA6 مع 4HB في الأعلى ومجال Ig-like في الأسفل، وتعتمد الألوان على تقديرات الحفظ من خادم ConSurf.أفضل الأجزاء حفظًا باللون الأزرق، والأجزاء متوسطة الحفظ باللون الأبيض، والأقل حفظًا باللون الأصفر.السيستين الأرجواني.تظهر ثلاث بقع سطحية توضح مستوى عالٍ من الحماية في الرقع الموضحة 1 و2 و3. ويظهر رسم كاريكاتوري 4HB في الشكل الداخلي في أعلى اليمين (نفس نظام الألوان).
يحتوي هيكل SPACA6 على ثلاث مناطق سطحية محفوظة للغاية (الشكل 6 ب).يمتد التصحيح 1 على 4HB ومنطقة المفصلة ويحتوي على جسرين من ثاني كبريتيد CXXC محفوظين، وشبكة مفصلية Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 (الشكل S7)، وثلاث بقايا عطرية خارجية محفوظة (Phe31، Tyr73، Phe137)).حافة أوسع للمجال الشبيه بالـ Ig (الشكل S6e)، والذي يمثل عدة بقايا موجبة الشحنة على سطح الحيوانات المنوية.ومن المثير للاهتمام أن هذا التصحيح يحتوي على حلقة جسم مضاد ثبت سابقًا أنها تتداخل مع وظيفة SPACA6 30.تمتد المنطقة 3 على المفصلة وجانب واحد من المجال الشبيه بـ Ig؛تحتوي هذه المنطقة على البرولينات المحفوظة (Pro126، Pro127، Pro150، Pro154) والبقايا القطبية/المشحونة المواجهة للخارج.من المثير للدهشة أن معظم البقايا الموجودة على سطح 4HB متغيرة بدرجة كبيرة (الشكل 6 ب)، على الرغم من الحفاظ على الطية في جميع أنحاء متجانس SPACA6 (كما هو موضح من خلال المحافظة على قلب الحزمة الكارهة للماء) وخارج عائلة IST الفائقة.
على الرغم من أن هذه هي أصغر منطقة في SPACA6 مع أقل عدد من عناصر البنية الثانوية التي يمكن اكتشافها، إلا أن العديد من بقايا المنطقة المفصلية (بما في ذلك المنطقة 3) يتم الحفاظ عليها بشكل كبير بين متجانسات SPACA6، مما قد يشير إلى أن اتجاه الحزمة الحلزونية والساندويتش الحلزوني يلعب دورًا.كمحافظ.ومع ذلك، على الرغم من الترابط الهيدروجيني الواسع والشبكات الكهروستاتيكية في المنطقة المفصلية لـ SPACA6 وIZUMO1، يمكن رؤية دليل على المرونة الجوهرية في محاذاة الهياكل المتعددة المسموح بها لـ IZUMO137،43،44.تتداخل محاذاة المجالات الفردية جيدًا، لكن اتجاه المجالات بالنسبة لبعضها البعض يختلف من 50 درجة إلى 70 درجة من المحور المركزي (الشكل S16).لفهم الديناميكيات التوافقية لـ SPACA6 في المحلول، تم إجراء تجارب SAXS (الشكل S17a، b).تتوافق عملية إعادة الإعمار الأولية للنطاق الخارجي SPACA6 مع البنية البلورية للقضيب (الشكل S18) ، على الرغم من أن مؤامرة Kratky أظهرت درجة معينة من المرونة (الشكل S17b).يتناقض هذا التشكل مع IZUMO1، حيث يتخذ البروتين غير المنضم شكلًا مرتدًا في الشبكة وفي المحلول.
لتحديد المنطقة المرنة على وجه التحديد، تم إجراء التحليل الطيفي الكتلي لتبادل الهيدروجين والديوتيريوم (H-DXMS) على SPACA6 ومقارنته بالبيانات التي تم الحصول عليها مسبقًا على IZUMO143 (الشكل 7 أ، ب).من الواضح أن SPACA6 أكثر مرونة من IZUMO1، كما يتضح من ارتفاع تبادل الديوتيريوم في جميع أنحاء الهيكل بعد 100000 ثانية من التبادل.في كلا الهيكلين، يُظهر الجزء الطرفي C من المنطقة المفصلية مستوى عالٍ من التبادل، والذي ربما يسمح بتدوير محدود للمجالات المشابهة لـ 4HB وIg بالنسبة لبعضها البعض.ومن المثير للاهتمام، أن الجزء الطرفي C من مفصل SPACA6، والذي يتكون من بقايا 147CDLPLDCP154، هو منطقة محفوظة للغاية 3 (الشكل 6 ب)، مما قد يشير إلى أن المرونة بين المجالات هي ميزة محفوظة تطوريًا لـ SPACA6.وفقًا لتحليل المرونة، أظهرت بيانات الذوبان الحراري للقرص المضغوط أن SPACA6 (Tm = 51.2 درجة مئوية) أقل استقرارًا من IZUMO1 (Tm = 62.9 درجة مئوية) (الشكل S1e وS19).
صور H-DXMS لـ SPACA6 و b IZUMO1.تم تحديد النسبة المئوية لتبادل الديوتيريوم في النقاط الزمنية المحددة.تتم الإشارة إلى مستويات تبادل الهيدروجين والديوتيريوم باللون على مقياس متدرج من الأزرق (10٪) إلى الأحمر (90٪).تمثل الصناديق السوداء مناطق ذات تبادل مرتفع.تظهر حدود 4HB والمفصلة والمجال الشبيه بـ Ig في التركيب البلوري أعلى التسلسل الأساسي.تم رسم مستويات تبادل الديوتيريوم عند 10 ثانية و1000 ثانية و100000 ثانية على مخطط شريطي متراكب على الأسطح الجزيئية الشفافة لـ SPACA6 وIZUMO1.أجزاء الهياكل التي يقل مستوى تبادل الديوتيريوم فيها عن 50% تكون ملونة باللون الأبيض.يتم تلوين المناطق التي تزيد عن 50% من تبادل H-DXMS بمقياس متدرج.
أدى استخدام كريسبر/كاس9 والاستراتيجيات الوراثية لتعطيل جينات الفأر إلى تحديد عدة عوامل مهمة لربط الحيوانات المنوية والبويضات واندماجها.بصرف النظر عن التفاعل المميز جيدًا بين بنية IZUMO1-JUNO وCD9، تظل معظم البروتينات المرتبطة باندماج الأمشاج غامضة من الناحية الهيكلية والوظيفية.يعد التوصيف الفيزيائي الحيوي والهيكلي لـ SPACA6 قطعة أخرى من لغز الالتصاق / الاندماج الجزيئي أثناء الإخصاب.
يبدو أن SPACA6 والأعضاء الآخرين في عائلة IST الفائقة محفوظون بدرجة عالية في الثدييات وكذلك الطيور والزواحف والبرمائيات الفردية؛في الواقع، يُعتقد أن SPACA6 مطلوب حتى للتخصيب في أسماك الزرد 59. ويشبه هذا التوزيع البروتينات المعروفة الأخرى المرتبطة بدمج الأمشاج مثل DCST134، وDCST234، وFIMP31، وSOF132، مما يشير إلى أن هذه العوامل تعاني من نقص HAP2 (أيضًا المعروفة باسم GCS1) البروتينات المسؤولة عن النشاط التحفيزي للعديد من الطلائعيات.والنباتات والمفصليات.بروتينات الاندماج المخصبة 60، 61. على الرغم من التشابه الهيكلي القوي بين SPACA6 وIZUMO1، إلا أن تعطيل الجينات التي تشفر أيًا من هذه البروتينات أدى إلى العقم لدى الفئران الذكور، مما يشير إلى أن وظائفها في اندماج الأمشاج لا تتكرر..على نطاق أوسع، لا يعد أي من بروتينات الحيوانات المنوية المعروفة المطلوبة لمرحلة الالتصاق من الاندماج زائدة عن الحاجة.
يبقى سؤالًا مفتوحًا ما إذا كان SPACA6 (وأعضاء آخرون في عائلة IST الفائقة) يشاركون في الوصلات بين الألعاب، أو يشكلون شبكات داخل الألعاب لتجنيد بروتينات مهمة في نقاط الاندماج، أو ربما يعملون كمولدات فوسوجين مراوغة.كشفت دراسات الهطول المناعي المشترك في خلايا HEK293T عن تفاعل بين IZUMO1 كامل الطول وSPCA632.ومع ذلك، لم تتفاعل المجالات الخارجية المؤتلفة لدينا في المختبر، مما يشير إلى أن التفاعلات التي شوهدت في Noda et al.تم حذفهما في البناء (لاحظ ذيل السيتوبلازم لـ IZUMO1، والذي ثبت أنه غير ضروري للتخصيب62).وبدلاً من ذلك، قد يتطلب IZUMO1 و/أو SPACA6 بيئات ربط محددة لا نتكاثرها في المختبر، مثل المطابقات المحددة من الناحية الفسيولوجية أو المجمعات الجزيئية التي تحتوي على بروتينات أخرى (معروفة أو لم تكتشف بعد).على الرغم من أنه يُعتقد أن المجال الخارجي IZUMO1 يتوسط ارتباط الحيوانات المنوية بالبويضة في الحيز المحيط بالمح، إلا أن الغرض من المجال الخارجي SPACA6 غير واضح.
يكشف هيكل SPACA6 عن العديد من الأسطح المحفوظة التي قد تكون متورطة في تفاعلات البروتين البروتين.يحتوي الجزء المحفوظ من منطقة المفصلة المتاخمة مباشرة لشكل CXXC (التصحيح المعين 1 أعلاه) على العديد من المخلفات العطرية المواجهة للخارج والتي غالبًا ما ترتبط بالتفاعلات الكارهة للماء والتراص بين الجزيئات الحيوية.تشكل الجوانب العريضة للمجال الشبيه بـ Ig (المنطقة 2) أخدودًا موجب الشحنة مع Arg وبقاياه المحفوظة بدرجة عالية، وقد سبق استخدام الأجسام المضادة ضد هذه المنطقة لمنع اندماج الأمشاج 30 .يتعرف الجسم المضاد على الحاتمة الخطية 212RIRPAQLTHRGTFS225، التي تحتوي على ثلاثة من بقايا الأرجينين الستة وHis220 المحفوظ بدرجة عالية.ليس من الواضح ما إذا كان الخلل ناتجًا عن انسداد هذه المخلفات المحددة أو المنطقة بأكملها.يشير موقع هذه الفجوة بالقرب من الطرف C للشطيرة β إلى تفاعلات رابطة الدول المستقلة مع بروتينات الحيوانات المنوية المجاورة، ولكن ليس مع بروتينات البويضات.علاوة على ذلك، فإن الاحتفاظ بتشابك عالي المرونة وغني بالبرولين (الموقع 3) داخل المفصلة قد يكون موقع تفاعل بروتين-بروتين أو، على الأرجح، يشير إلى الاحتفاظ بالمرونة بين المجالين.الجنس مهم للدور غير المعروف لـ SPACA6.اندماج الأمشاج.
يحتوي SPACA6 على خصائص بروتينات الالتصاق بين الخلايا، بما في ذلك شطائر بيتا التي تشبه Ig.تمتلك العديد من البروتينات اللاصقة (على سبيل المثال، الكادهيرين، والإنتجرين، والمواد اللاصقة، وIZUMO1) واحدًا أو أكثر من نطاقات الساندويتش التي تمد البروتينات من غشاء الخلية إلى أهدافها البيئية63،64،65.يحتوي مجال SPACA6 الشبيه بـ Ig أيضًا على فكرة شائعة في شطائر الالتصاق والتماسك: ثنائيات من الخيوط المتوازية في نهايات شطائر بيتا، المعروفة باسم المشابك الميكانيكية66.ويعتقد أن هذا الشكل يزيد من مقاومة قوى القص، وهو أمر مهم للبروتينات المشاركة في التفاعلات بين الخلايا.ومع ذلك، على الرغم من هذا التشابه مع المواد اللاصقة، لا يوجد حاليا أي دليل على أن SPACA6 يتفاعل مع بياض البيض.المجال الخارجي SPACA6 غير قادر على الارتباط بـ JUNO، وخلايا HEK293T المعبرة عن SPACA6، كما هو موضح هنا، بالكاد تتفاعل مع البويضات التي تفتقر إلى المنطقة 32.إذا أنشأ SPACA6 روابط بين الألعاب، فقد تتطلب هذه التفاعلات تعديلات ما بعد الترجمة أو يمكن تثبيتها بواسطة بروتينات الحيوانات المنوية الأخرى.ودعمًا للفرضية الأخيرة، ترتبط الحيوانات المنوية التي تعاني من نقص IZUMO1 بالبويضات، مما يدل على أن الجزيئات الأخرى غير IZUMO1 متورطة في خطوة التصاق الأمشاج رقم 27.
العديد من بروتينات الاندماج الفيروسية والخلوية والتنموية لها خصائص تتنبأ بوظيفتها كمولدات فوسوجين.على سبيل المثال، تحتوي البروتينات السكرية الاندماجية الفيروسية (الفئات الأولى والثانية والثالثة) على ببتيد اندماجي كاره للماء أو حلقة في نهاية البروتين الذي يتم إدخاله في غشاء المضيف.لم تظهر خريطة المحبة للماء لـ IZUMO143 والبنية (المحددة والمتوقعة) لعائلة IST الفائقة أي ببتيد اندماجي كاره للماء.وبالتالي، إذا كانت أي بروتينات في فصيلة IST الفائقة تعمل كمولدات فوسوجينية، فإنها تفعل ذلك بطريقة مختلفة عن الأمثلة المعروفة الأخرى.
في الختام، تظل وظائف أعضاء فصيلة البروتينات IST الفائقة المرتبطة باندماج الأمشاج لغزًا محيرًا.سيوفر جزيء SPACA6 المؤتلف المميز وبنيته التي تم حلها نظرة ثاقبة للعلاقات بين هذه الهياكل المشتركة ودورها في ارتباط الأمشاج واندماجها.
تم تحسين ترميز تسلسل الحمض النووي المطابق للمجال الخارجي SPACA6 البشري المتوقع (رقم وصول NCBI NP_001303901.1؛ البقايا 27-246) للتعبير في خلايا Drosophila melanogaster S2 وتم تصنيعه كجزء من الجينات مع تسلسل ترميز Kozak (Eurofins Genomics).، إشارة إفراز BiP ونهايات 5 ′ و 3 ′ المقابلة للاستنساخ المستقل لهذا الجين في ناقل تعبير pMT استنادًا إلى مروج الميتالوثيونين المعدل للاختيار باستخدام بوروميسين (pMT-puro).يقوم ناقل pMT-puro بتشفير موقع انقسام الثرومبين متبوعًا بعلامة 10x-His C-terminal (الشكل S2).
تم إجراء ترنسفكأيشن مستقر لناقل SPACA6 pMT-puro إلى خلايا D. melanogaster S2 (Gibco) بشكل مشابه للبروتوكول المستخدم في IZUMO1 وJUNO43.تم إذابة خلايا S2 ونموها في وسط شنايدر (جيبكو) مع إضافة تركيز نهائي قدره 10٪ (حجم / حجم) مصل العجل الجنيني المعطل بالحرارة (جيبكو) ومضاد حيوي مضاد للفطريات 1X (جيبكو).تم طلاء خلايا المرور المبكر (3.0 × 106 خلية) في آبار فردية مكونة من 6 لوحات جيدة (كورنينج).بعد 24 ساعة من الحضانة عند 27 درجة مئوية، تم نقل الخلايا بمزيج من 2 ملغ من ناقل SPACA6 pMT-puro وكاشف ترنسفكأيشن Effectene (Qiagen) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة.تم تحضين الخلايا المنقولة لمدة 72 ساعة ثم تم حصادها باستخدام 6 ملغم / مل من البروميسين.تم بعد ذلك عزل الخلايا من وسط شنايدر الكامل ووضعها في وسط Insect-XPRESS الخالي من المصل (Lonza) لإنتاج البروتين على نطاق واسع.تمت زراعة مجموعة 1 لتر من ثقافة الخلايا S2 إلى 8-10 × 106 مل -1 خلية في قارورة Erlenmeyer من مادة البولي بروبيلين ذات القاع المسطح والمهواة سعة 2 لتر ثم تم تعقيمها بتركيز نهائي قدره 500 ميكرومتر CuSO4 (Millipore Sigma) وتصفيتها.الناجم عن.تم تحضين الزراعات المحدثة عند 27 درجة مئوية وبسرعة 120 دورة في الدقيقة لمدة أربعة أيام.
تم عزل الوسط المكيف الذي يحتوي على SPACA6 عن طريق الطرد المركزي عند 5660 × جم عند 4 درجات مئوية متبوعًا بنظام ترشيح التدفق العرضي Centramate (Pall Corp) مع غشاء 10 كيلو دالتون MWCO.تطبيق المتوسطة المركزة التي تحتوي على SPACA6 إلى 2 مل راتنجات الاغاروز Ni-NTA (Qiagen).تم غسل راتينج Ni-NTA باستخدام 10 أحجام أعمدة من المخزن المؤقت A ثم تمت إضافة 1 CV من المخزن المؤقت A لإعطاء تركيز إيميدازول نهائي قدره 50 مم.تمت تصفية SPACA6 بـ 10 مل من المخزن المؤقت A المضاف إلى إيميدازول إلى تركيز نهائي قدره 500 ملم.تمت إضافة الثرومبين من فئة التقييد (Millipore Sigma) مباشرة إلى أنابيب غسيل الكلى (MWCO 12-14 كيلو دالتون) عند وحدة واحدة لكل ملغ SPACA6 مقابل 1 لتر 10 ملي مولار Tris-HCl، ودرجة الحموضة 7.5 و150 ملي مول كلوريد الصوديوم (المخزن المؤقت B) لغسيل الكلى.) عند 4 درجات مئوية لمدة 48 ساعة.تم بعد ذلك تخفيف SPACA6 المشقوق بالثرومبين ثلاثة أضعاف لتقليل تركيز الملح وتحميله على عمود تبادل الكاتيون 1 مل MonoS 5/50 GL (Cytiva / GE) تمت معايرته بـ 10 مللي مولار Tris-HCl، درجة الحموضة 7.5.تم غسل المبادل الكاتيوني باستخدام 3 CV من 10 مللي مولار Tris-HCl، ودرجة الحموضة 7.5، ثم تم شطف SPACA6 بتدرج خطي من 0 إلى 500 مللي مول كلوريد الصوديوم في 10 مللي مولار Tris-HCl، ودرجة الحموضة 7.5 لمدة 25 السيرة الذاتية.بعد كروماتوجرافيا التبادل الأيوني، تم تركيز SPACA6 إلى 1 مل وتم شطفه بشكل متساوي من عمود ENrich SEC650 10 × 300 (BioRad) تمت معايرته باستخدام المخزن المؤقت B. وفقًا للكروماتوجرام، وتجمع الكسور المركزة التي تحتوي على SPACA6.تم التحكم في النقاء عن طريق الرحلان الكهربائي الملطخ بـ Coomassie على هلام بولي أكريلاميد SDS بنسبة 16٪.تم قياس تركيز البروتين عن طريق الامتصاص عند 280 نانومتر باستخدام قانون بير لامبرت ومعامل الانقراض المولي النظري.
تم غسيل SPACA6 المنقى طوال الليل مقابل 10 ملي مولار من فوسفات الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.4 و150 ملي مولار NaF وتم تخفيفه إلى 0.16 ملجم / مل قبل التحليل بواسطة التحليل الطيفي للقرص المضغوط.تم جمع المسح الطيفي للأقراص المضغوطة ذات الطول الموجي من 185 إلى 260 نانومتر على مقياس الطيف الضوئي Jasco J-1500 باستخدام قواطع الكوارتز بطول مسار بصري 1 مم (Helma) عند 25 درجة مئوية بمعدل 50 نانومتر / دقيقة.تم تصحيح أطياف القرص المضغوط، وبلغ متوسطها أكثر من 10 عمليات استحواذ، وتم تحويلها إلى متوسط ​​الإهليلجية المتبقية (θMRE) بالدرجات cm2/dmol:
حيث MW هو الوزن الجزيئي لكل عينة في دا؛N هو عدد الأحماض الأمينية.θ هي الإهليلجية بالمللي درجة؛d يتوافق مع طول المسار البصري بالسنتيمتر؛تركيز البروتين بالوحدات